轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)生物多樣性的影響

陳彥君, 李俊生, 閆 冰, 關(guān) 瀟*, 陶 均

1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 國(guó)家環(huán)境保護(hù)區(qū)域生態(tài)過(guò)程與功能評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100012 2.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院, 海南 ?？?570228 3.江西省科學(xué)院能源研究所, 江西 南昌 330096

轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化25年以來(lái)，總種植面積累計(jì)達(dá)到25×108hm2[1]. 在作物生長(zhǎng)過(guò)程中，蟲(chóng)害的發(fā)生以及除草劑的施用嚴(yán)重危害著其產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量. 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入抗蟲(chóng)、抗除草劑基因可有效降低靶標(biāo)害蟲(chóng)的數(shù)量，降低作物對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的依賴，緩解除草劑對(duì)作物的影響[2]，但其是否會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成影響仍需要進(jìn)行全方位的安全性測(cè)定，這也是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容.

對(duì)生物多樣性的影響研究作為轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全釋放的必要環(huán)節(jié)之一，目前已開(kāi)展大量相關(guān)研究，但結(jié)論不盡相同. 部分研究表明，轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)根際土壤微生物[3-6]、昆蟲(chóng)[7-10]、雜草[10-12]等的群落結(jié)構(gòu)與組成無(wú)顯著影響，但也有學(xué)者認(rèn)為其種植會(huì)影響田間生物多樣性[13-16]，研究結(jié)果的差異表明轉(zhuǎn)基因作物種植后可能對(duì)生物多樣性產(chǎn)生的影響并非一概而論，受體及外源基因等的差異都可能影響研究結(jié)果. 因此，對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)工作應(yīng)遵循“個(gè)案原則”[17].

Cry1Ah基因的主要靶標(biāo)動(dòng)物為鱗翅目昆蟲(chóng)，對(duì)其具有較高的殺蟲(chóng)活性，但對(duì)家蠶等重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性相對(duì)較低，表現(xiàn)出良好的環(huán)境安全性[18]，具有廣闊的應(yīng)用前景，但其是否會(huì)對(duì)生物多樣性產(chǎn)生顯著影響仍處于探索階段. 鑒于此，該文以轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60為研究對(duì)象，重點(diǎn)討論其對(duì)根際土壤微生物、田間節(jié)肢動(dòng)物以及田間雜草的影響，以期為轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為生物安全管理的健康發(fā)展提供支持.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

該研究于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院海南樂(lè)東南繁生物育種試驗(yàn)基地進(jìn)行. 該基地位于海南島西南部樂(lè)東黎族自治縣，屬熱帶季風(fēng)性氣候，年均氣溫為23.9～25.2 ℃，光照充足，熱量豐富，年降水量約 1 000 mm，但水量不平衡，干季、雨季分明. 選用玉米品種為轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60(簡(jiǎn)稱“HGK60”)及其對(duì)照常規(guī)玉米鄭58(簡(jiǎn)稱“鄭58”)，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供.

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，試驗(yàn)組為HGK60，對(duì)照組為鄭58，每個(gè)處理均設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)(小區(qū))面積為150 m2(10 m×15 m). 各小區(qū)間設(shè)置1 m寬的空白隔離帶，種植方式為一穴一粒、一穴兩粒循環(huán)播種，行距為60 cm，株距為25 cm. 玉米于2018年11月播種，田間管理同常規(guī)種植.

1.2 樣品采集與處理

1.2.1根際土壤樣品的采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序

樣品采集. 在玉米生長(zhǎng)的苗期、喇叭口期、抽穗期、完熟期以及玉米收獲后，采用“抖根法”按照五點(diǎn)采樣法采集根際土壤樣品，取樣時(shí)避開(kāi)道路等可能影響因素. 土壤樣品用干冰保存帶回置于-80 ℃ 下.

DNA提取. 選用FastDNA? SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, US)試劑盒提取根際土壤微生物總DNA，采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度、純度.

PCR擴(kuò)增. 針對(duì)V1～V9區(qū)，以稀釋后的基因組DNA為模板，使用通用引物8F(5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和1509R(5′-GNTACCTTGTTACGAC TT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增. PCR反應(yīng)體系(50 μL)：Trans Fastpfu 1 μL，5×Buffer 10 μL，5×StimuLate 5 μL，dNTPs(2.5×10-3mol/L each) 5 μL，Primer Mix(1 μmol/L) 2 μL，gDNA 1 μL，NFW 26 μL. PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度98 ℃(2 min)；變性溫度95 ℃(30 s)，退火溫度60 ℃(45 s)，延伸溫度72 ℃(90 s)，35個(gè)循環(huán)后72 ℃終止延伸10 min. 根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等質(zhì)量混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，割膠回收目標(biāo)條帶. 所用試劑盒為QIAGEN公司QIAquick@ Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒.

高通量測(cè)序. 使用PACIFIC BIOSCIENCES(PacBio)公司的SMRTbellTMTemplate Prep Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，通過(guò)Qubit定量和FEMTO Pulse檢測(cè)片段大小，庫(kù)檢合格后使用PacBio的Sequel平臺(tái)進(jìn)行16S全長(zhǎng)rDNA測(cè)序. 該研究測(cè)序工作委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成.

1.2.2節(jié)肢動(dòng)物調(diào)查

在玉米生長(zhǎng)的苗期、喇叭口期、抽穗期和完熟期，采用五點(diǎn)法于每個(gè)生育期分別進(jìn)行3次節(jié)肢動(dòng)物調(diào)查：①直接觀察法，各點(diǎn)位調(diào)查15株玉米，記錄植株上節(jié)肢動(dòng)物種類和數(shù)量；②陷阱調(diào)查法，各小區(qū)埋設(shè)25個(gè)(每個(gè)點(diǎn)位放5個(gè))塑料杯，塑料杯直徑7.5 cm，間隔0.5 m，于調(diào)查的前一天在塑料杯中放置1/3容量的5%防凍液，24 h后記錄節(jié)肢動(dòng)物的種類和數(shù)量.

1.2.3雜草調(diào)查

分別在玉米生長(zhǎng)的苗期、喇叭口期、抽穗期、完熟期于各小區(qū)按照五點(diǎn)法，避開(kāi)調(diào)查節(jié)肢動(dòng)物時(shí)所設(shè)陷阱，選取5個(gè)1 m2(1 m×1 m)的樣方，調(diào)查并記錄樣方內(nèi)雜草種類和數(shù)量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1根際土壤微生物

1.3.1.1測(cè)序數(shù)據(jù)處理

將PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，使用Lima軟件根據(jù)Barcode序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù). 進(jìn)行CCS(Circular Consensus Sequencing)校正及長(zhǎng)度過(guò)濾，過(guò)濾含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列及引物切除. 對(duì)處理后得到的序列進(jìn)行去除嵌合體處理，通過(guò)UCHIME v7.0.1090與Silva全長(zhǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù).

1.3.1.2OTU聚類和物種注釋

利用Uparse v7.0.1001軟件對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成可操作分類單元OTUs(Operational Taxonomic Units). 依據(jù)相應(yīng)算法原則，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為其代表序列. 對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與Silva(http://www.arb-silva.de)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)，獲得分類學(xué)信息并統(tǒng)計(jì)各分類水平上各樣本的群落組成. 使用MUSCLE v3.8.31軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系. 最后以數(shù)據(jù)量最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)分析均基于均一化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行. 使用R v2.15.3軟件繪制門水平上的前10位物種相對(duì)豐度柱形圖與屬水平上的前35位物種相對(duì)豐度聚類熱圖，并對(duì)同一生育期的組間差異進(jìn)行分析(T檢驗(yàn)).

1.3.1.3樣品復(fù)雜度分析(alpha diversity)

使用Qiime v1.9.1軟件計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Phylogenetic diversity指數(shù)(簡(jiǎn)稱“PD指數(shù)”)，使用R v2.15.3軟件進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)組間差異分析(非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)).

1.3.1.4多樣品比較分析(beta diversity)

用Qiime v1.9.1軟件計(jì)算Weighted-Unifrac距離. 使用R v2.15.3軟件進(jìn)行(NMDS)，并進(jìn)行beta多樣性指數(shù)組間相似性分析(Analysis of Similarities, ANOSIM).

1.3.2節(jié)肢動(dòng)物與雜草的統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)分析玉米各生育期田間節(jié)肢動(dòng)物和雜草的群落結(jié)構(gòu)與組成，計(jì)算各生態(tài)學(xué)指數(shù).

Margalef指數(shù)(Dmg)：

Dmg=(S-1)/lnN

(1)

Shannon-Wiener指數(shù)(H)：

(2)

Simpson指數(shù)(D)：

(3)

Pielou指數(shù)(J)：

J=H/lnS

(4)

式中：S為物種個(gè)數(shù)；Pi=Ni/N，其中Ni為第i個(gè)物種的個(gè)體數(shù)，N為總個(gè)體數(shù)[19].

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行兩兩T檢驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)根際土壤微生物的影響

將根際土壤樣品的高通量測(cè)序序列經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾后，共得到 633 812 條有效序列. 各樣品的高通量測(cè)序序列范圍為 6 480～55 762 條，平均有效序列為 21 127 條. 根據(jù)樣品中最小有效序列數(shù)，每個(gè)樣品隨機(jī)挑選 6 480 條有效序列進(jìn)行樣品測(cè)序深度的均一化處理. 以97%的一致性(Identity)將其聚類成OTUs，共注釋到34門、188科、524屬.

2.1.1物種相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)根際土壤微生物門水平上的物種相對(duì)豐度，豐度前10位的門分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、未鑒定出的細(xì)菌(unidentified-bacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria). 其中，厚壁菌門在各處理中的相對(duì)豐度為18.88%～45.61%、變形菌門為24.52%～37.68%、酸桿菌門為9.28%～13.16%，且在各處理中相對(duì)豐度均大于5%，為優(yōu)勢(shì)種群.

結(jié)合T檢驗(yàn)，比較HGK60與鄭58根際土壤微生物發(fā)現(xiàn)，酸桿菌門、浮霉菌門、綠彎菌門在各生育期的相對(duì)豐度均差異不顯著(P>0.05)；厚壁菌門僅在抽穗期和完熟期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，變形菌門僅在抽穗期和完熟期表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，放線菌門僅在完熟期表現(xiàn)為二者差異顯著(P<0.05)，擬桿菌門、芽單胞菌門僅在抽穗期表現(xiàn)為二者差異顯著(P<0.05)，但收獲后HGK60與鄭58在前10個(gè)門的相對(duì)豐度差異均不顯著(P>0.05)(見(jiàn)圖1).

根據(jù)所有樣品屬水平上的物種注釋，選取相對(duì)豐度前35位的屬繪制聚類熱圖(見(jiàn)圖2). 比較同一生育期HGK60與鄭58根際土壤微生物發(fā)現(xiàn)，部分物種存在一定差異，但僅出現(xiàn)在某個(gè)生育期，并未在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 苗期，Chitinophaga、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)等的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為HGK60低于鄭58，寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Pelomonas等的相對(duì)豐度則表現(xiàn)為HGK60高于鄭58；喇叭口期，嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)、Occallatibacter等的相對(duì)豐度表現(xiàn)為HGK60高于鄭58；抽穗期，Haliangium、Crenobacter等的相對(duì)豐度表現(xiàn)為HGK60低于鄭58；完熟期，Aquicella、Dechlorobacter等的相對(duì)豐度均表現(xiàn)為HGK60低于鄭58. 這表明HGK60的種植會(huì)在某些生育期對(duì)部分屬水平上的物種產(chǎn)生一定影響.

圖1 門水平上的前10的物種相對(duì)豐度Fig.1 The relative abundance of top 10 soil microorganisms at the phyla level

圖2 不同植株根際土壤中微生物前35個(gè)屬相對(duì)豐度聚類熱圖Fig.2 The relative abundance histogram of top 35 soil microorganisms at the genus level by heatmap

從生育期的角度來(lái)看，玉米根際土壤微生物部分屬水平上的物種呈現(xiàn)一定的季節(jié)性差異. 溶桿菌屬(Lysobacter)、類諾卡氏屬(Nocardioides)等的相對(duì)豐度主要表現(xiàn)為收獲后相對(duì)較高，玉米生長(zhǎng)期間則相對(duì)較低；Tumebacillus等的相對(duì)豐度表現(xiàn)為喇叭口期明顯高于其他生育期；Pseudogulbenkiania、Crenobacter、Pseudolabrys、Aquicella等的相對(duì)豐度主要表現(xiàn)為抽穗期、完熟期相對(duì)較高，其他生育期則相對(duì)較低. 部分物種呈現(xiàn)一定的季節(jié)性特征，說(shuō)明生育期是影響根際土壤微生物的因素之一. 但是由于聚類熱圖只能通過(guò)圖中不同處理間顏色的差異對(duì)處理間差異進(jìn)行判斷，無(wú)法進(jìn)行有效量化，需要結(jié)合多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果做進(jìn)一步分析.

2.1.2alpha多樣性指數(shù)與beta多樣性聚類分析

對(duì)HGK60與鄭58各生育期根際土壤細(xì)菌群落的alpha多樣性進(jìn)行非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn). Shannon-Wiener指數(shù)分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58僅在抽穗期、完熟期差異顯著(P<0.05)；Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)在各生育期均表現(xiàn)為二者差異不顯著(P>0.05)；ACE指數(shù)僅表現(xiàn)為收獲后二者差異顯著(P<0.05)；PD指數(shù)則表現(xiàn)為僅抽穗期、完熟期二者差異顯著(P<0.05). 從整體上看，HGK60的種植不會(huì)對(duì)土壤微生物alpha多樣性產(chǎn)生持續(xù)性影響，部分影響主要存在于抽穗期與完熟期，除ACE指數(shù)外，收獲后HGK60與鄭58在各生態(tài)指標(biāo)上差異均不顯著(P>0.05)(見(jiàn)表1).

在beta多樣性分析中，根據(jù)不同生育期玉米根際土壤樣品的測(cè)序結(jié)果，基于Weighted-UniFrac進(jìn)行NMDS分析，以此對(duì)HGK60與鄭58根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性及差異性進(jìn)行定性分析(見(jiàn)圖3). 結(jié)合ANOSIM分析，比較同一生育期HGK60與鄭58，發(fā)現(xiàn)抽穗期、完熟期二者間差異顯著(P<0.05)，苗期、喇叭口期、收獲后二者均差異不顯著(P>0.05)，表明HGK60種植產(chǎn)生的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響僅出現(xiàn)在某些生育期，并未在整個(gè)生長(zhǎng)階段持續(xù)存在，且收獲后差異不顯著(P>0.05). 從生育期的角度來(lái)看，不同生育期玉米根際土壤樣品細(xì)菌群落存在明顯差異，喇叭口期與抽穗期、完熟期與收獲后均表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05).

表1 玉米根際土壤微生物的alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes of rhizosphere soil microorganism

圖3 非度量多維尺度(NMDS)分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling

2.2 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的影響

在HGK60與鄭58田間共調(diào)查到節(jié)肢動(dòng)物 19 835 頭，二者分別有 9 727 和 10 108 頭，隸屬于7目19科60種(見(jiàn)表2). 比較同一生育期HGK60與鄭58玉米田間節(jié)肢動(dòng)物數(shù)量分析，螟蛾科在苗期、喇叭口期、抽穗期均表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，其他物種的差異只表現(xiàn)在某個(gè)生育期，并不會(huì)在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn)(見(jiàn)表3)，夜蛾科僅在抽穗期表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，緣蝽科、盲蝽科、葉蟬科僅在喇叭口期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，飛虱可僅在完熟期HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，蚜科僅在苗期、完熟期表現(xiàn)為二者差異顯著(P<0.05)，草蛉科僅在抽穗期表現(xiàn)為HGK60顯著低于鄭58(P<0.05)，瓢蟲(chóng)科僅在苗期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，薊馬總科則僅在喇叭口期HGK60顯著低于鄭58(P<0.05).

表2 田間節(jié)肢動(dòng)物群落的目、科、種分布Table 2 Patterns of the arthropod community in the fields in different orders, families and species

表3 各生育期田間節(jié)肢動(dòng)物數(shù)量Table 3 The number of arthropods in each growth period 頭

比較HGK60與鄭58田間節(jié)肢動(dòng)物群落的Margalef指數(shù)發(fā)現(xiàn)，僅抽穗期表現(xiàn)為HGK60顯著高于鄭58(P<0.05)，其他生育期均表現(xiàn)為二者差異不顯著(P>0.05)〔見(jiàn)圖4(A)〕. Shannon-Wiener指數(shù)分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58在各生育期差異均不顯著(P>0.05)〔見(jiàn)圖4(B)〕. Simpson指數(shù)表現(xiàn)為僅喇叭口期HGK60與鄭58差異顯著(P<0.05)，其他生育期二者差異均不顯著(P>0.05)〔見(jiàn)圖4(C)〕. Pielou指數(shù)分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58田間節(jié)肢動(dòng)物Pielou指數(shù)的變化范圍在0.9～1.0之間，且二者在各生育期差異均不顯著(P>0.05)〔見(jiàn)圖4(D)〕.

圖4 田間節(jié)肢動(dòng)物群落各生態(tài)指標(biāo)Fig.4 The ecological indexes of arthropods in the fields

2.3 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)田間雜草的影響

調(diào)查結(jié)果顯示，HGK60與鄭58田間雜草發(fā)生種類有8科16種，多為一年生雜草(見(jiàn)表4). 各生育期內(nèi)HGK60與鄭58的田間雜草密度差異均不顯著(P>0.05)(見(jiàn)圖5). 比較田間各雜草種類，發(fā)現(xiàn)僅喇叭口期的蒼耳表現(xiàn)為HGK60與鄭58差異顯著(P<0.05)，其他生育期、其他物種均表現(xiàn)為二者差異不顯著(P>0.05).

由圖6可見(jiàn)，HGK60與鄭58田間雜草群落Margelef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)的變化趨勢(shì)一致，且各生育期二者無(wú)顯著差異(P>0.05)；HGK60與鄭58的Pielou指數(shù)變化范圍在0.8～1.0之間，HGK60僅在苗期顯著高于鄭58(P<0.05)，其他生育期二者差異不顯著(P>0.05).

2.4 討論

2.4.1轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)根際土壤微生物的影響

該研究結(jié)果顯示，HGK60種植后對(duì)根際土壤微生物的影響僅出現(xiàn)在某些生育期，并不會(huì)在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 對(duì)門水平上相對(duì)豐度前10位根際土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、變形菌門、酸桿菌門在各生育期均為優(yōu)勢(shì)種群，其中厚壁菌門與變形菌門的相對(duì)豐度均在抽穗期和完熟期表現(xiàn)為HGK60與鄭58差異顯著，其他生育期之間差異均不顯著；酸桿菌門則在各生育期均表現(xiàn)為二者差異不顯著. 玉米收獲后前10個(gè)門均表現(xiàn)為HGK60與鄭58差異不顯著，認(rèn)為HGK60的種植不會(huì)對(duì)玉米根際土壤微生物門水平產(chǎn)生持續(xù)且顯著的影響. 厚壁菌門的內(nèi)在物種具有降解土壤中難溶化合物[20]、固定空氣中氮[21]、防治植物病蟲(chóng)害[22]等作用，具有較強(qiáng)的降解能力和代謝活性，其在抽穗期、完熟期HGK60根際土壤中的相對(duì)豐度顯著高于鄭58，表明該生長(zhǎng)階段HGK60的種植可有效增強(qiáng)土壤固氮、病蟲(chóng)害防治及代謝能力等. 變形菌門廣泛分布于各類環(huán)境中，其在農(nóng)業(yè)、環(huán)保、衛(wèi)生等領(lǐng)域具有重要價(jià)值與作用[23-25]. 變形菌門的相對(duì)豐度在抽穗期、完熟期HGK60根際土壤中顯著低于鄭58，但收獲后二者差異不再顯著，表明HGK60的種植對(duì)變形菌門的影響過(guò)程相對(duì)較短且不持續(xù).

表4 田間雜草數(shù)量調(diào)查結(jié)果Table 4 The number of each species in the fields 株

圖5 田間雜草密度Fig.5 Weed density in the fields

圖6 田間雜草各生態(tài)指標(biāo)Fig.6 The ecological indexes of weeds in the fields

對(duì)前35個(gè)屬的研究發(fā)現(xiàn)，同一生育期HGK60與鄭58根際土壤微生物中金黃桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、嗜糖假單胞菌屬等的相對(duì)豐度存在差異，但亦只出現(xiàn)在某些生育期，并未在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 值得注意的是，金黃桿菌屬可降解苯胺、甲基叔丁基醚等難降解有機(jī)物[26]；寡養(yǎng)單胞菌屬對(duì)甲基對(duì)硫磷具有較高的降解性能[27]；嗜糖假單胞菌屬也具有降解有機(jī)物的作用[28]. 雖然以上物種均未對(duì)玉米根際土壤產(chǎn)生持續(xù)且顯著的影響，但仍值得關(guān)注，以充分發(fā)揮其功效，增加其對(duì)土壤微環(huán)境的良性作用.

對(duì)根際土壤微生物alpha多樣性的研究結(jié)果顯示，HGK60種植對(duì)土壤微生物的影響主要存在于抽穗期與完熟期，收獲后HGK60與鄭58在Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、PD指數(shù)上的差異均不顯著；beta多樣性研究亦發(fā)現(xiàn)，抽穗期、完熟期HGK60與鄭58差異顯著，苗期、喇叭口期、收獲后二者均差異不顯著，與alpha多樣性的研究結(jié)果較為一致，均表明HGK60的種植雖在部分生育期對(duì)根際土壤微生物產(chǎn)生了顯著影響，但該影響并未持續(xù)存在，玉米收獲后HGK60與鄭58間差異不顯著. 已有學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生物開(kāi)展了研究，但并未得到十分明確的結(jié)論. 部分研究認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)根際土壤微生物無(wú)顯著影響[29-34]；但也有研究認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物的種植會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性等產(chǎn)生顯著影響[35-36]. 上述差異說(shuō)明轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)土壤微生物多樣性的影響可能與作物類型、轉(zhuǎn)入的外源基因、研究方法等有關(guān)，不可一概而論，需要進(jìn)一步深入研究.

從生育期的角度分析玉米根際土壤微生物的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)生育期的推進(jìn)會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定影響. ANOSIM分析結(jié)果顯示，HGK60與鄭58均表現(xiàn)出在喇叭口期與抽穗期、完熟期與收獲后兩兩生育期間的顯著差異. 一些學(xué)者也得出了生育期會(huì)對(duì)作物根際土壤微生物產(chǎn)生一定影響的結(jié)論[37-39].

2.4.2轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的影響

通過(guò)對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物群落的研究發(fā)現(xiàn)，HGK60主要對(duì)螟蛾科昆蟲(chóng)有抑制作用. 從整體上看，HGK60種植對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的多個(gè)生態(tài)指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響，差異僅出現(xiàn)在個(gè)別生育期，并未在整個(gè)生育期持續(xù)出現(xiàn). 部分研究亦得出了轉(zhuǎn)基因玉米種植不會(huì)對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物產(chǎn)生顯著影響的結(jié)論[7-9]，與筆者所得結(jié)果較為一致. 但是也有研究得出了不同的結(jié)論，認(rèn)為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的種植會(huì)在一定程度上造成田間天敵昆蟲(chóng)數(shù)量的下降以及非靶標(biāo)昆蟲(chóng)數(shù)量的上升[40]；也有部分研究認(rèn)為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物可能會(huì)提高田間節(jié)肢動(dòng)物群落的豐富度和多樣性，從而提高生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[41].

2.4.3轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)田間雜草的影響

對(duì)田間雜草的研究結(jié)果顯示，HGK60的種植對(duì)田間種類、數(shù)量及各生態(tài)學(xué)指標(biāo)等均無(wú)顯著影響，與趙思楠[42]得出的轉(zhuǎn)G10evo-epsps基因和Cry1Ab/Cry2Aj融合基因抗蟲(chóng)耐草甘膦玉米雙抗12-6對(duì)田間雜草多樣性無(wú)顯著影響的研究結(jié)果較為一致；劉來(lái)盤等[10]對(duì)抗除草劑大豆田間雜草進(jìn)行調(diào)查，認(rèn)為其對(duì)雜草群落組成與多樣性也無(wú)顯著影響. 但也有研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因作物種植可改變田間單子葉、雙子葉雜草比例[43]，其競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)搶占生存空間及次生代謝發(fā)生改變，可能產(chǎn)生“化感”作用，抑制雜草生長(zhǎng)，抗蟲(chóng)作物通過(guò)影響害蟲(chóng)取食習(xí)性變化也可對(duì)田間雜草產(chǎn)生間接影響[44]. 從已有研究結(jié)果來(lái)看，不同作物、不同轉(zhuǎn)入基因等對(duì)田間雜草的研究結(jié)果差異較大，表明了轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境壓力反應(yīng)的復(fù)雜性.

3 結(jié)論

a) 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60種植對(duì)根際土壤微生物的影響僅出現(xiàn)在某些生育期，其對(duì)抽穗期、完熟期的影響相對(duì)較大，但該影響并不會(huì)在玉米的整個(gè)生長(zhǎng)階段持續(xù)出現(xiàn)，玉米收獲后HGK60與鄭58差異不顯著(P>0.05)；生育期是影響根際土壤微生物的重要因素之一.

b) 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60對(duì)螟蛾科昆蟲(chóng)具有顯著抑制作用(P<0.05)，但對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物的種類及Margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)等生態(tài)學(xué)指標(biāo)均無(wú)顯著影響(P>0.05).

c) 轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米HGK60種植對(duì)田間雜草密度及Margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)等生態(tài)學(xué)指標(biāo)均無(wú)顯著影響(P>0.05).