HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸高級別病變篩查中的應用分析

厲瑤 胡旻 胡美旭 陳盼

子宮頸癌具有高發病率和高致死率。我國目前宮頸癌篩查率仍較低，2010年全國城市篩查率約為29.1%，在農村僅為16.9%［1］。因此，積極尋找合理有效的宮頸病變篩查方法對于防治宮頸癌至關重要。持續高危型HPV感染是引起宮頸病變的主要原因。以往，臨床上多采用HPV-DNA檢測與TCT相聯合的方式進行宮頸病變的篩查與隨訪。近來一些研究發現，HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV-DNA檢測在篩查宮頸病變中具有相似的靈敏度，而且特異性更高［2］。在有條件的醫院，其被逐漸應用于宮頸病變的篩查。但目前尚缺乏大樣本的臨床研究探討HPV E6/E7 mRNA檢測的應用價值和優勢。本研究通過回顧性分析1596例確診為宮頸高級別病變（CINⅡ+）患者的宮頸篩查結果，以進一步評估HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸高級別病變篩查中的優越性和診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月至2019年12月本院婦科就診且病理檢查確診為宮頸上皮內瘤變≥Ⅱ級病變（CINⅡ+）的患者1596例，年齡25～66歲，平均年齡（40.75±8.90）歲。（1）納入標準：①有性生活史；②既往無宮頸病變。③確診前1年內均在本院行TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA中1項或多項檢測，并記錄檢測結果。（2）排除標準：①妊娠期婦女；②近期有生殖器炎癥；③既往曾行宮頸手術或子宮切除手術；④既往曾行盆腔放療或化學治療；⑤無法配合檢查者。

1.2 方法 （1）取樣方法：取樣時間必須為非月經期，并且保證取樣前3 d內無性生活，2 d內無陰道沖洗或陰道給藥。患者取膀胱截石位，置入窺陰器后暴露子宮頸，在子宮頸管內順時針旋轉3～5周子宮頸取樣刷，最后將刷頭完全浸泡于細胞保存液中。當天送檢所有樣本。（2）HPV E6/E7 mRNA 檢測：采用QuantivirusTM支鏈DNA雜交捕獲原理檢測HPV E6/E7 mRNA，試劑盒為宮頸穩態檢測試劑盒（購自鄭州科蒂亞生物技術有限公司）。可定量檢測14種高危型HPV，分別為HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型。按照說明書進行檢測，檢測探針是針對上述14種高危人乳頭狀瘤病毒的E6/E7 mRNA，只要其中任一種存在結果就顯示為陽性。（3）HPV-DNA檢測：采用購自上海透景公司的檢測試劑盒，方法為流式微球法，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。一共檢測27種HPV亞型，分別為高危型HPV：HPV-DNA-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82型和低危型HPV：HPV-DNA-06、11、40、42、43、44、55、61、81、83型，任一陽性即判定為HPV DNA檢測陽性。（4）TCT檢查：采用全自動液基細胞制片儀（購自杭州海世嘉科技有限公司），對子宮頸脫落細胞進行均化、轉移、制片，最后固定及染色后閱片。子宮頸細胞學診斷按照2001年國際癌癥協會推薦的Bethesda分類系統（TBS）的標準。TCT檢測結果≥未明確意義的不典型鱗狀上皮細胞或腺上皮細胞（ASCUS或AGC）者即視為細胞學檢測陽性。（5）病理學診斷方法：根據患者陰道鏡下宮頸多點活檢的病理標本，通過專業病理醫師閱片，將病理標本組織學結果明確分為以下5類：①良性細胞改變；②宮頸上皮內瘤變Ⅰ級（CINⅠ）；③宮頸上皮內瘤變Ⅱ級（CINⅡ）；④宮頸上皮內瘤變Ⅲ級（CINⅢ）或宮頸原位癌；⑤宮頸浸潤癌。病理檢查結果明確為宮頸上皮內瘤變≥Ⅱ級（CINⅡ+）的患者為入組樣本。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件。計數資料以（%）表示，用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種篩查方法單獨或聯合篩查漏檢率比較 見表1。

表1 三種篩查方法單獨或聯合篩查的漏檢率

2.2 不同TCT結果下HPV E6/E7 mRNA檢出率比較 378例患者行TCT+HPV E6/E7 mRNA聯合篩查。TCT陽性312例，HPV E6/E7 mRNA陽性298例。TCT細胞病理結果分級越高，HPV E6/E7 mRNA檢出率越高（χ2趨勢=13.824，P＜0.05）。見表3。

表3 不同TCT細胞病理結果下HPV E6/E7 mRNA檢出率［n（%）］

3 討論

2014年，WHO推薦用HPV分型檢測作為子宮頸癌初篩的方法［3］。HPV-DNA檢測與細胞學篩查相比，具有更高的可重復性和靈敏度。但由于HPV-DNA檢測僅能表明患者有無HPV病毒感染，無法證明宿主細胞中有無病毒整合，因此在宮頸高級別病變患者甚至宮頸癌患者中仍存在較高的陰性率［4］。本資料中，HPVDNA檢測與HPV E6/E7 mRNA檢測相比其漏檢率較高。分析原因：（1）主觀原因為臨床醫師在標本采集時采集的細胞量過少或遭受雜質影響；（2）本院HPV-DNA檢測技術已涵蓋高危型和低危型共27種HPV亞型，但仍有較多其他的HPV亞型也可引起高級別宮頸病變甚至子宮頸癌，比如HPV 90型。有研究表明［5］，在宮頸細胞學檢查異常的高危人群中，有3.9%的婦女檢測出HPV 90型陽性。（3）部分特殊類型的宮頸癌患者的疾病發生與HPV病毒并無直接關系。如在透明細胞癌的HPV病毒陰性率為80.0%，在宮頸微偏腺癌的患者中HPV病毒陰性率達91.7%［6］。

以往，臨床上常用宮頸刮片（巴氏涂片法）進行細胞學篩查，但由于其制片過程復雜粗略，漏檢率高已被逐漸淘汰。TCT檢查雖然優于傳統的巴氏涂片法，但相比HPV病毒檢測漏檢率仍較高。究其原因可能與以下因素有關：（1）采集標本時由于宮頸病灶局限，取樣刷未能刷到病灶處的異常細胞或標本采集的細胞量不足；（2）部分患者宮頸移行帶未在采集范圍內；（3）TCT檢查結果與病理診斷醫師的水平與經驗密切相關，主觀性較強，且目前國內尚缺乏統一的婦科病理診斷醫師培訓體系。TCT檢查僅基于細胞學特征進行初步病理診斷，無法全面觀察到整體細胞組織學結構。因此相比宮頸活檢病理組織診斷方法，在取材、形態學觀察時，易受主觀因素影響，具有更高的誤診和漏診率，局限性較大。

近年來研究發現，與HPV DNA檢測相比，HPV E6/E7 mRNA檢測方法在篩查高級別子宮頸病變和子宮頸癌中具有相似的敏感度和更高的特異度［7］。當患者受高危型HPV持續感染后，以整合形式存在于宿主細胞內的HPV會轉錄大量癌基因E6、E7 mRNA 并生成E6、E7癌蛋白，引起真正癌前病變和子宮頸癌［8］。其可以通過檢測患者的 E6/E7 mRNA表達，推測癌基因表達活性，進一步評估細胞病變的趨勢。美國FDA已批準將HPV E6/E7 mRNA檢測作為＞21歲細胞學診斷為ASCUS婦女的診斷分流，并推薦＞30歲婦女行HPV E6/E7 mRNA檢測聯合細胞學檢查進行宮頸病變篩查［9］。

本資料中，單獨行HPV E6/E7 mRNA檢測的漏檢率低于TCT和HPV DNA檢測，且差異有統計學意義。其優越性主要在于：（1）主要應用雜交捕獲原理和PCR原理進行檢測，比基于形態學的TCT 檢查方法更加敏感；（2）大部分HPV病毒感染在女性中僅為一過性，HPV DNA病毒檢測不能確定HPV感染的活動程度是否有進一步惡變可能。HPV E6/E7 mRNA更能準確反映HPV病毒在細胞內的復制轉錄活躍程度。一項Meta分析［10］納入了8項宮頸癌篩查研究，分析顯示這些研究人群中HPV E6/E7 mRNA檢測檢出CINⅡ+的靈敏度和HPV DNA檢測相當，但特異度前者明顯更高，分別為 0.82（95%CI 0.80～0.83）和0.65（95%CI 0.62～0.67），差異有統計學意義。本資料結果顯示，隨著細胞病理分級越高，HPV E6/E7 mRNA的檢出率也越高。表明隨著子宮頸病變嚴重程度的增加，其表達水平也相應增高，這與歐麗瀅等［11-12］研究相符。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸高級別病變篩查中具有較高的特異度和靈敏度，其與TCT檢查聯合進行篩查，可大幅度提高精確率，減少漏檢率。但對于評估HPV E6/E7 mRNA檢測在普通人群篩查中的有效性及經濟學效益，仍有待多中心、大樣本量的研究進一步明確。