吉林部分地區TTSuVs與PCV2混合感染情況調查及其與PMWS相關性分析

劉東旭，沙萬里,尹柏雙,李國江*

(1.吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101；2.吉林省教育廳預防獸醫學吉林省重點實驗室，吉林 吉林 132101)

仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)是一種重要的病毒性傳染病，它能造成仔豬全身各系統不同程度的功能喪失。該病主要由豬圓環病毒2型(porcine circovirus tape 2，PCV2)引起[1]。豬細環病毒(Torque teno sus viruses，TTSuVs)最早發現于2002年，現流行于多個國家的豬群中，目前被分成2個基因型，即TTSuV1和TTSuV2[2]。臨床研究表明，豬群單一感染TTSuVs并不能引起明顯的臨床癥狀；豬群單一感染PCV2也同樣不會引起明顯的臨床癥狀，但豬群混合感染兩種病原體時，會促進PMWS的發生。這使得關于TTSuVs在豬群中的感染情況及潛在的致病性成為研究的熱點[3]。

為此，本研究對吉林部分地區TTSuVs與PCV2混合感染情況進行調查，并分析PMWS病豬及PCV2亞臨床感染豬體內TTSuVs的載量，這將有助于進一步認識TTSuVs在豬群中的感染情況及其潛在致病性，為研究TTSuVs的致病機理及PCV2等疾病的防制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒基因組提取試劑盒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、RNaseA，購自TaKaRa公司。

1.2 血清樣品

2019年1月起從吉林省10家規模化豬場隨機收集到的血清樣品130份。

1.3 引物及探針

檢測應用實驗室已有的PCV2和TTSuVs熒光定量PCR引物和探針，引物和探針具體信息見表1所示。

表1 PCR擴增引物序列信息Table 1 PCR primer sequence information

1.4 TTSuVs和PCV2流行情況調查

將2019年1月起從吉林省10家規模化豬場收集到的130份血清樣品，按照TaKaRa公司病毒基因組提取試劑盒說明書提取病毒DNA。應用劉建波等[4]建立設計的TTSuVs及PCV2引物對提取的病毒基因組進行PCR檢測，并統計分析吉林地區2019年TTSuVs和PCV2的感染情況。

1.5 PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品的確定

應用本實驗室已建立好的PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測方法對血清樣品中PCV2的濃度進行檢測(擴增程序：預變性，95 ℃ 30 s；變性，95 ℃ 10 s；退火，56.6 ℃ 30 s；35個循環)，根據血清樣品中的PCV2濃度，應用公式：Copies/mL=6.02×1023×濃度/平均分子量，計算病毒拷貝數，并根據計算結果區分PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品。

1.6 TTSuVs載量與PMWS相關性分析

應用本實驗室已建立好的TTSuVs TaqMan熒光定量PCR檢測方法對1.5中的PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品進行TTSuVs載量分析(TTSuV1擴增程序：預變性，95 ℃ 30 s；變性，95 ℃ 10 s；退火，54.6 ℃ 30 s；35個循環。TTSuV2擴增程序：預變性，95 ℃ 30 s；變性，95 ℃ 10 s；退火，55.6 ℃ 30 s；35個循環)。用t檢驗方法對PMWS病豬和PCV2亞臨床感染豬PCV2載量、TTSuVs載量分別進行差異顯著性分析，并對三種病毒載量進行直線相關分析。

2 結果與分析

2.1 吉林部分地區TTSuVs和PCV2流行情況調查

對2019年1月起從10家規模化豬場收集到的130份血清樣品進行PCR鑒定，結果見表2。其中共檢出50份TTSuV1陽性樣品，其感染率為38.46%；75份TTSuV2陽性樣品，感染率為57.69%；60份PCV2陽性樣品，感染率為46.15%；TTSuV1與TTSuV2的混合感染樣品有41份，混合感染率為31.54%；TTSuV1與PCV2的混合感染樣品有42份，混合感染率為32.30%；TTSuV2與PCV2的混合感染樣品有58份，混合感染率為44.62%；三種病毒的混合感染樣品有29份，混合感染率為22.30%。且中部地區為吉林主要發病地區，結果見表3。

表2 2019年吉林地區TTSuVs和PCV2流行情況調查Table 2 Epidemic survey of TTSuVs and PCV2 in Jilin in 2019

表3 吉林地區2018年TTSuVs及PCV2分布情況Table 3 Distribution of TTSuVs and PCV2 in Jilin Region in 2018

2.2 PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品的確定

對PCV2陽性病料，應用本實驗室已建立的熒光定量PCR檢測方法對其中PCV2的載量進行測定。資料顯示，PCV2感染豬發展成為PMWS病豬所需要的病毒載量的臨界值是，每微升血清中含有的病毒載量為1×104copies[5]。故參考這個標準，將血清中PCV2載量低于1×104copies/μL的判定為PCV2亞臨床感染，將血清中PCV2載量高于1×104copies/μL的判定為PMWS病豬。根據此標準檢測的130份樣品中個，PCV2亞臨床感染45份，PMWS病豬47份。其中PMWS病豬血清中PCV2載量范圍介于104.13～106.91copies/μL之間，平均值為105.32copies/μL；PCV2亞臨床感染豬中PCV2載量范圍介于100.91～103.68copies/μL之間，平均值為101.72copies/μL。PMWS病豬血清中PCV2載量高于PCV2亞臨床感染豬，并且二者之間差異性顯著(P<0.05)，結果見表4。

表4 PMWS病豬、PCV2亞臨床感染豬血液樣本中三種病毒載量比較Table 4 Comparison of three viral loads in blood samples from PMWS diseased pigs and PCV2 subclinically infected pigs(Log10(DNA)(copies/μL))

2.3 PCV2亞臨床感染豬與PMW病豬的TTSuVs載量比較分析

對檢測的45份PCV2亞臨床感染樣本和47份PMWS病豬樣本，用本研究建立的熒光定量PCR方法檢測其中的TTSuVs載量。結果如表5所示。結果表明，PMWS病豬血清中TTSuV1載量范圍介于0～103.21copies/μL之間，平均值為101.36copies/μL；PCV2亞臨床感染豬中TTSuV1載量范圍介于0～103.12copies/μL之間，平均值為101.58copies/μL。PMWS病豬血清中TTSuV1載量與PCV2亞臨床感染豬TTSuV1載量差異性不顯著(P>0.05)。PMWS病豬血清中TTSuV2載量范圍介于0～103.52copies/μL之間，平均值為102.24copies/μL；PCV2亞臨床感染豬中TTSuV2載量范圍介于0～102.42copies/μL之間，平均值為101.34copies/μL。PMWS病豬血清中TTSuV2載量高于PCV2亞臨床感染豬，并且二者之間差異性顯著(P<0.05)。

2.4 TTSuV2載量與PCV2載量的相關性分析

通過上述數據分析可見，PMWS病豬血清中TTSuV2載量是高于PCV2亞臨床感染豬的，并且二者之間差異性達到了顯著水平，因此有必要進一步分析其間是否存在一定程度的相關性。將PCV2感染豬中PCV2載量的對數值與TTSuV2載量的對數值進行直線相關與回歸分析，結果如圖1所示。由圖1可以看出，二者之間存在部分擬合性(R2=0.3441)，提示臨床上TTSuV2感染與PMWS發生之間存在一定關聯。

圖1 血清中TTSuV2載量和PCV2載量之間的相關性分析Fig.1 Correlation analysis on TTSuV2 load and PCV2 load in serum

3 討 論

PMWS的出現以及爆發對我國養豬行業造成了極大的經濟損失。PMWS可見于5～16周齡豬，但最常見于6～8周齡。豬群患病率為3%～50%，死亡率在8%～35%。發病豬中大約有半數于2～8d內死亡，其他半數豬在衰弱狀態下可存活數周，幾乎沒有康復的豬，致死率為80%～100%。本病發展緩慢，豬群一次發病可持續12～18個月。成年豬一般為隱性感染，常不表現任何癥狀和病變，但可以排毒。自PMWS報道以來，圍繞著PMWS病原研究一直在進行。Ellis等[6]研究表 明PCV2與PMWS高度相關。然而PCV2是PMWS的主要病因，但可能不是唯一的病原。有研究表明TTSuVs與PCV2的混合感染會導致豬群發生PWMS。Ellis等[6]的研究發現，50%的豬在感染TTSuVl后，再感染PVC2會出現急性PMWS癥狀，而單獨感染2種病毒的任何一種，或者先感染PCV2再感染TTSuVl均未出現PMWS癥狀，預示TTSuVl與PCV2混合感染時，可能導致豬群暴發PMWS。Kekarainen等[7]對西班牙PMWS和非PMWS豬群中TTSuVs感染情況的調查也發現，TTSuV2在PMWS發病豬群中的陽性率比非PMWS豬群明顯偏高。

為此本項目對2019年吉林部分地區規模化豬場TTSuVs與PCV2混和感染情況進行調查。結果顯示，TTSuV1其感染率為38.46%；TTSuV2感染率為57.69%； PCV2感染率為46.15%；TTSuV1與TTSuV2的混合感染率為31.54%；TTSuV1與PCV2的混合感染樣率為32.30%；TTSuV2與PCV2的混合感染率為44.62%；三種病毒的混合感染率為22.30%。與李海超[8](PCV2感染率71.37%，；TTSuV1與PCV2的混合感染樣率為44.05%；TTSuV2與PCV2的混合感染率為36.12%)和張青占[9]的調查結果部分相近(PCV2感染率75.73%；TTSuV1與PCV2的混合感染樣率為32.02%；TTSuV2與PCV2的混合感染率為61.08%)，說明TTSuVs及PCV2混合感染已在我國多省份流行，但流行情況各個地域間差異較大。

應用建立的熒光定量PCR方法來檢測TTSuV1、TTSuV2、PCV2的病毒載量，比較PMWS病豬與PCV2亞臨床感染豬的血清中TTSuV1載量、TTSuV2載量、PCV2載量的差異。結果發現，PMWS病豬的血清中TTSuV2載量極顯著的高于PCV2亞臨床感染豬，兩者之間存在差異性(P<0.01)，但前者的TTSuV1載量與后者并無顯著差異。對所有PCV2感染豬的TTSuV2與PCV2載量的相關分析結果顯示，二者之間有顯著相關，提示TTSuV2感染與PMWS發生之間可能存在相關性，這與一些國內外研究資料基本一致[10-11]。這些資料除報道PMWS病豬的血液中的TTSuV2載量顯著高于PCV2亞臨床感染豬外，還報道前者的TTSuV2陽性率明顯高于后者；本研究觀察到類似現象。這說明隨著PMWS的發生，TTSuV2載量同時增加，提示TTSuV2與PCV2之間在一定條件下，二者的混合感染完全可能引起一定比例的PMWS。