多種因素對小鼠卵母細胞體外受精效果影響的分析

張景鋒,郝京京,徐秋良,朱寬佑,牛 暉,張長興

(1.河南牧業經濟學院 動物科技學院，河南 鄭州 450046；2.河南省畜禽遺傳資源保護工程技術研究中心，河南 鄭州 450046)

體外受精是指哺乳動物的精子和卵子在體外人為控制的環境中完成受精過程的技術。這項技術于20世紀50年代取得了成功，該技術在瀕危動物和優良家畜品種的后代續繁、性別控制、品種資源保存等方面的應用具有重大意義，最大優點是能夠打破時間和空間限制[1-3]。鑒于此，科研人員模擬卵母細胞在體內受精和胚胎發育的情況，研究獲得高受精率和高胚胎發育率的方法，從而提高體外受精的效果[4-5]。在不同激素對卵母細胞體外受精的影響方面，有研究者提出促卵泡素(FSH)和胰島素對小鼠卵母細胞體外成熟有提高作用，并且胰島素的效果要比FSH的效果更加好，但是對于體外受精率，胰島素添加組要比FSH組低4.6%[6-7]。李凱等[8]研究結果顯示，小鼠卵母細胞經過1 000 ng/mL雌二醇處理后，卵裂率低于其它試驗組，這種現象的出現可能是因為高濃度的雌激素對小鼠卵母細胞的受精能力有抑制作用。在不同添加劑對卵母細胞體外受精的影響方面，有學者提出牛血清白蛋白(BSA)具有降低小鼠體外受精率的作用，認為卵母細胞透明帶在含有BSA的體系中發生硬化[9]。郭勇等[10]研究結果證明人的重組促黃體生成素(r-hLH)對小鼠卵母細胞的體外受精有明顯的促進作用， 同時對相應胚胎進一步發育產生明顯的抑制作用。朱佳偉等[11]研究結果顯示半胱氨酸和胱氨酸通過促進小鼠體外成熟卵母細胞合成谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的方法提高受精率，這種提高與濃度有很大的關系，并且只有在200 μM才能顯著提高，更高濃度具有相反的效果。安鐵洙等[12]研究結果表明在M16培養液中添加EDTA和L-谷氨酰胺后，小鼠卵母細胞體外受精率有了明顯的提高，由原來的26%提高到51%，并且進一步指出這種現象可能是由于EDTA與某些金屬離子發生螯合作用的結果，而谷氨酰胺一般被認為是胚胎發育48 h內的主要能源物質。沈維干等[13]提出氟化鈉具有明顯的生殖毒性，其對卵母細胞的成熟具有破壞作用，同時還會降低卵母細胞的受精能力。在不同操作方法對卵母細胞體外受精的影響方面，研究者將卵母細胞分為卵丘卵母細胞、裸卵和人為操作的裸卵(即機械裸卵)，其中裸卵的體外受精率要比卵丘卵母細胞復合體的體外受精率高。同時，其它研究也證明卵丘和透明帶對卵母細胞體外受精起重要的作用[14-15]。但在體外受精相關研究中，由于試驗方法和培養液等條件的不同，試驗過程中卵裂率也不盡相同，所以本試驗研究不同精子獲能時間，精卵孵育時間，精子密度以及顆粒細胞等條件對卵母細胞體外受精的影響，從而探索和優化小鼠卵母細胞體外受精及早期胚胎發育的最適環境。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用試驗動物為昆明系小白鼠，SPF等級，22～25 g雌鼠，共30只，8～10周齡雄鼠，共10只，購置于鄭州大學試驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 礦物油(M8410,500 mL)、透明質酸酶購自Sigma；孕馬血清促性腺激素PMSG購自寧波第二激素廠；卵母細胞體外成熟培養液(M2)、精子獲能液(HTF)、體外受精液(TYH)、胚胎培養液(KSOM)購自南京愛貝生物科技有限公司；PBS、M199(含Hepes)購自GIBCO；四孔板購自NUNC；塑料細胞培養皿(35 mm)、塑料細胞培養皿(60 mm)購自NEST；一次性針頭濾器(0.22 μM)購自Millipore。

1.3 小鼠卵母細胞的體外成熟

選取健康未孕的昆明系雌性小鼠，采用腹腔注射方法注入孕馬血清促性腺激素(PMSG)，每只小鼠注入10 IU，48 h后頸部脫臼法處死小鼠，剪開腹腔并摘取卵巢。卵巢首先放入PBS中洗去血液和脂滴，再放入提前準備好的體外操作液M199(含Hepes)中，整個操作在37 ℃恒溫板上進行；用1 mL注射器針頭刺破卵巢表面的卵泡，釋放出卵母細胞。在體式顯微鏡下用吸卵針挑選出形狀規則，胞質均勻的GV期卵母細胞，包括帶有顆粒細胞的卵母細胞(COCs)和不帶顆粒細胞的卵母細胞(NO)，在卵母細胞體外成熟培養液M2中洗2～3次，放入提前做好的M2培養液液滴中洗2～3次，最后放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養14 h后，排出第一極體的體外成熟卵母細胞進行后續的體外受精試驗。

1.4 小鼠卵母細胞的體外受精

1.4.1 小鼠精子的采集和體外獲能 選取健康的昆明系雄性小鼠，將小鼠頸部脫臼致死，將睪丸，附睪和輸精管一起剪下，放入提前備好的PBS中清洗，洗去脂滴和血液，并使附睪和輸精管與睪丸分離，附睪和輸精管放入提前平衡好的300 μL HTF中，撕碎附睪和輸精管，而后放入CO2培養箱孵育10 min，使精子游出。精子游出后，HTF中的碎組織剔除后離心，離心時間為3 min，2 000 r/min。離心完畢，棄去上清液，在離心管中加入已經平衡好的200 μL HTF，然后放入37 ℃，5% CO2細胞培養箱中進行精子的體外獲能，根據不同的獲能時間分為40 min、60 min和80 min三個試驗組。上述過程均需要在37 ℃恒溫板上進行。

1.4.2 小鼠卵母細胞和精子的孵育 將獲能完成后的精子進行離心，時間為3 min，2 000 r/min。離心后棄去上清液，在沉淀物中加入提前平衡好的TYH，混合均勻后調整精子密度，根據不同的精子密度分為3×105個/mL、3×106個/mL和3×107個/mL三個試驗組；將體外成熟的卵母細胞COCs和NO分別在TYH中洗2～3次，移入含有精子的TYH中，然后放入37 ℃，5% CO2的細胞培養箱進行體外受精，根據不同的受精時間分為2 h、4 h、6 h、8 h四個試驗組。整個操作過程均需在37 ℃恒溫板上進行。

1.4.3 小鼠早期胚胎的培養 卵母細胞和精子在TYH中分別培養2 h、4 h、6 h、8 h后，將受精后的卵母細胞從TYH中移出，用預熱過的KSOM中洗2～3次，移入平衡好的KSOM中，培養24 h后觀察受精卵卵裂情況，并計算卵裂率。

1.5 數據分析

試驗數據用SPSS22.00軟件進行分析，數據用“平均值±標準差”表示，采用F檢驗對試驗結果進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 精子獲能時間對小鼠卵母細胞體外受精的影響

由表1可以看出，在COCs體外受精試驗中，精子獲能時間40 min、60 min、80 min的試驗組間受精卵卵裂率沒有顯著差異，精子獲能時間80 min試驗組受精卵卵裂率最高。在NO體外受精試驗中，精子獲能時間60 min試驗組受精卵卵裂率最高，獲能時間80 min試驗組卵裂率最差。精子獲能時間60 min試驗組與精子獲能時間40 min試驗組間無顯著差異，與精子獲能時間80 min試驗組間存在顯著差異(P<0.05)。綜上所述，精子獲能時間對NO的卵裂率存在一定影響，精子獲能時間為60 min試驗組的卵裂率最高，精子獲能時間對于COCs卵裂率不存在顯著影響。

表1 精子獲能時間對小鼠卵母細胞體外受精的影響Table 1 Effect of the sperm capacitation time on mouse oocyte fertilization in vitro

2.2 精卵孵育時間對小鼠卵母細胞體外受精的影響

由表2可以看出，在COCs體外受精試驗中，精卵孵育時間為2 h的試驗組，受精卵卵裂率最高，與精卵孵育時間4 h、6 h試驗組間均沒有顯著差異。精卵孵育時間為8 h的試驗組，受精卵卵裂率最低。精卵孵育時間2 h、4 h、6 h試驗組與精卵孵育時間8 h試驗組間存在顯著差異，且受精卵卵裂率顯著高于精卵孵育時間8 h試驗組(P<0.05)。在NO體外受精試驗中，精卵孵育時間為6 h試驗組的卵裂率最高，與精卵孵育時間2 h試驗組間沒有顯著差異，與精卵孵育時間4 h差異顯著(P<0.05)，與8 h試驗組間存在極顯著差異(P<0.01)，而且精卵孵育時間8 h的試驗組中受精卵卵裂率最低。綜上所述，精卵孵育時間對小鼠卵母細胞體外受精結果存在影響，COCs體外受精結果顯示精卵孵育時間2 h獲得的效果最好，NO的精卵孵育時間為6 h時效果最好。

表2 精卵孵育時間對小鼠卵母細胞體外受精的影響Table 2 Effect of sperm-egg incubation time on mouse oocyte fertilization in vitro

2.3 精子密度對小鼠卵母細胞體外受精的影響

由表3可以看出，在COCs體外受精試驗中，精子密度3×105/mL試驗組的受精卵卵裂率最高，精子密度為3×105/mL試驗組與精子密度為3×106/mL試驗組之間沒有顯著差異，精子密度為3×107/mL試驗組與精子密度3×106/mL試驗組、精子密度3×105/mL試驗組間存在顯著差異(P<0.05)，顯著低于精子密度為3×106/mL和精子密度為3×105/mL試驗組的受精卵卵裂率。在NO體外受精試驗中，精子密度為3×106/mL試驗組的卵裂率最高。精子密度3×106/mL試驗組的卵裂率顯著高于精子密度3×105/mL試驗組(P<0.05)，而且極顯著高于精子密度3×107/mL試驗組(P<0.01)。綜上所述，精子密度對于卵母細胞卵裂率有影響，NO和COCs體外受精過程中，均是當精子密度為3×106/mL時，受精卵的卵裂效果最好。

表3 精子密度對小鼠卵母細胞體外受精的影響Table 3 Effect of sperm density on mouse oocyte fertilization in vitro

2.4 顆粒細胞對小鼠卵母細胞體外受精的影響

由表4可以看出，在小鼠卵母細胞體外受精過程中，NO的卵裂率與COCs的卵裂率之間存在顯著差異(P<0.05)，NO的卵裂率要顯著高于COCs的卵裂率。

表4 顆粒細胞對小鼠卵母細胞體外受精的影響Table 4 Effect of granulose cells on mouse oocyte fertilization in vitro

3 討 論

在卵母細胞體外受精過程中，將獲能后的精子與體外培養成熟的卵母細胞進行精卵孵育時發現，在COCs體外受精過程中，精卵孵育2 h試驗組的卵裂率最高，達到36.09%；在NO體外受精過程中，精卵孵育6 h試驗組的卵裂率最高，達到55.99%。而江楠等[16]研究小鼠卵母細胞體外受精的結果顯示精卵共孵育2 h時，受精率達到85.4%，囊胚形成率達到75.6%。與本研究結果相差20%，對比之后發現原因可能是由于精子體外獲能液與受精液不同所造成的。本文所用的精子獲能液為TYH獲能液，體外受精液為HTF，而江楠等[16]在卵母細胞培養，精子獲能，體外受精以及胚胎早期培養時所用培養液均為HTF，并且在培養液中添加了牛血清清蛋白，計量為4 g/L。在 HTF體外受精液含有高鈣配方，這可能是造成出現上述結果的原因。

在研究顆粒細胞對小鼠卵母細胞體外受精的影響過程中，將培養成熟后的卵母細胞分為COCs以及NO兩個試驗組，試驗結果顯示NO卵裂率達到55.99%，COCs卵裂率僅為33.75%，兩者之間存在顯著差異，NO卵裂率要顯著高于COCs卵裂率。這個試驗結果與劉淑娟等[17]在昆白系小鼠體外受精一文中指出的結果不同，顆粒細胞對于小鼠的體外受精有一定的促進作用，并且指出，顆粒細胞可增加精子對透明帶的敏感性，具有防止透明帶變硬和延長卵母細胞壽命的作用。而有研究進一步指出，去除卵丘細胞的卵母細胞的受精率要低于沒有去除卵丘細胞的卵母細胞受精率，并指出原因可能是由于經過透明質酸酶處理的卵母細胞的透明帶結構發生了改變，導致受精率下降。試驗結果存在差異的原因是多方面的，精子獲能液，體外受精液，胚胎培養液的不同，均有可能出現與其他科研人員結果不一致的情況。其中，在胚胎培養階段，很多研究者采用卵裂培養液G1，囊胚培養液G2，可以得到較高的卵裂率。段彪等[18]在精子獲能時間及精卵共孵育時間對小鼠體外受精和胚胎發育的影響一文中采用G-IVF作為受精液，以G1/G2作為胚胎發育液，在獲能時間60 min，受精時間為6 h的情況下受精率達到86.4%，卵裂率達到85.4%。這個結果比本文用HTF作為受精液，KSOM作為胚胎培養液的卵裂率高出近30%。出現這種情況的原因是由于G1/G2系統中存在不同成分的組合，這些成分之間有互補效應。G1/G2系統含有氨基酸，而KSOM培養液中沒有。其中，G1培養液中含有一些非必需氨基酸以及谷氨酰胺，這些對于小鼠早期胚胎的卵裂率有一定的提高作用，而在G2培養液中，則包括有G1培養液中所含有的成分和一些必需氨基酸，對于不含有谷氨酰胺的必需氨基酸則有助于提高8細胞以后的胚胎發育[19]。