西藏牦牛源枯草芽孢桿菌的分離培養及鑒定

謝曉佩,王 琦,孔新平,吳慶俠*,董海龍,李家奎，曾江勇

(1.西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏自治區農科院 畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850000)

近年來，益生菌(Probiotics)制劑受到了眾多關注并獲得了廣泛的研制及應用，以避免使用抗生素帶來的DNA污染、細菌耐藥性、甚至超級細菌等危害。2001年世界衛生組織(WHO)和世界糧農組織(FAO)將益生菌定義為攝入一定數量后對宿主健康有益的活菌[1]。益生菌具有改善動物胃腸道平衡、促進動物生長、提高飼料利用率、增進動物健康、改善畜產品品質和養殖環境等作用[2]。由于飼料加工貯藏運輸過程中需要對菌體進行滅活處理，所以提高益生菌制品的穩定性很重要。芽孢菌因特殊的結構決定了其特殊的物理性質，抗逆性強，存活率高，易生長，是無毒、無殘留、無污染的綠色添加劑?？莶菅挎邨U菌作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，具有廣闊的發展前景和巨大的生態效益和社會效益[3]。牦牛生長環境特殊，牦牛用益生菌最好分離自健康牦牛[4]。本試驗采集西藏林芝健康牦牛的新鮮糞便，分離并篩選出具備較好耐受性的牦牛源枯草芽孢桿菌，為牦牛專用益生菌制劑的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設備與試劑

Milli-O○RAdvantage A10○R超純水系統-超純水機，高壓滅菌鍋，恒溫恒濕培養箱(購自上海博訊實業有限公司)，生化培養箱，恒溫水浴鍋，磁力攪拌器(購自金壇市盛藍儀器制造有限公司)，超凈工作臺(購自江蘇蘇靜集團)，離心機(購自美國Thermo公司)，搖床(購自河南兄弟儀器設備有限公司)，顯微鏡(購自日本OLYMPUS公司)，梯度PCR儀(購自日本TAKARA公司)，電泳儀，凝膠成像系統(購自杭州朗基科學儀器有限公司)等。

MRS培養基，LB培養基，普通營養肉湯(NB)培養基，麥康凱培養基，各濃度酒精，3%雙氧水，牛肉膏，Kovac氏試劑，瓊脂糖，細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，二甲苯等由西藏農牧學院獸醫樓提供?？焖俑锾m氏染色液，芽孢染色液，細菌藥敏紙片，糖類生化反應管，明膠液化培養基，豬膽鹽，硫化氫微量發酵管，Simmons枸櫞酸鹽等由杭州濱和微生物試劑有限公司提供。通用引物由武漢擎科創新生物有限公司提供。

1.2 樣品的采集和處理

適量采取健康牦牛的新鮮糞便，分裝加入到經滅菌冷卻后的營養肉湯培養基中，置于搖床中37 ℃預培養15 min，然后經80 ℃水浴處理15 min，每5 min震蕩搖勻一次[5-6]，可初步篩選過濾掉部分雜菌。然后于離心機中以4 000 r/min的轉速離心15 min，吸取上層液體，接種于營養肉湯培養基，于搖床中37 ℃倒置培養24 h。

1.3 枯草芽孢桿菌的分離

用移液槍吸取適量營養肉湯培養基中的培養物，用接種針分別涂布于選擇培養基、MRS瓊脂培養基、LB營養瓊脂培養基，進行劃線分離培養，于恒溫培養箱37 ℃培養24 h。挑選在培養基上形態疑似枯草芽孢桿菌的單菌落，涂片，染色，顯微鏡觀察。經多次分離培養，得出牦牛源枯草芽孢桿菌在選擇培養基上的生長狀況最好。之后從選擇培養基上挑取疑似枯草芽孢桿菌的單個菌落，多次接種于選擇培養基上劃線分離，純化培養。

1.4 枯草芽孢桿菌的增菌培養

經純化培養和多次涂片染色鏡檢后，挑取選擇培養基上疑似枯草芽孢桿菌的單菌落接種于營養肉湯培養基、選擇液體培養基、MRS液體培養基、LB液體培養基中進行增菌培養。經多次培養，得出枯草芽孢桿菌在營養肉湯培養基上的生長狀況最好。之后顯微鏡觀察細菌形態，確定液體培養物為純培養物，不含雜菌。

1.5 枯草芽孢桿菌的鑒定

1.5.1 形態學鑒定 做細菌抹片，分別采用革蘭氏染色、孔雀石綠染色、芽孢染色，置油鏡觀察。

1.5.2 生化鑒定 根據《獸醫微生物學實驗指導》實驗七“細菌的生化試驗”對分離細菌進行常規的生理生化鑒定[7]。(1)糖類分解試驗：用移液槍吸取枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養物，分別接種至葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蕈糖、菊糖等糖類生化反應管中，37 ℃培養24 h。(2) 吲哚試驗：以接種環將選擇培養基上枯草芽孢桿菌的純培養物接種于滅菌處理后的Dunham氏蛋白胨水溶液中，37 ℃培養48 h，向培養液中加入2～3 mL二甲苯，搖勻，靜置片刻，然后沿試管壁加人2 mL Kovac氏試劑。(3) VP試驗：取枯草芽孢桿菌的24 h純培養物，用無菌接種環接種于葡萄糖蛋白胨水培養基中，于37 ℃培養48～72 h。取出后在培養液中先加0.6 mLVP試劑甲液，再加乙液0.2 mL,充分混勻。放在試管架上，靜置15 min后培養液呈紅色者為陽性，不變色為陰性。(4)枸櫞酸鹽利用試驗：取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養物，用移液槍接種至枸櫞酸鹽生化管中，37 ℃培養48 h。(5)硫化氫試驗：用移液槍吸取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養物，接種至硫化氫生化管中，37 ℃培養24 h。(6)過氧化氫酶試驗：用接種環勾取枯草芽孢桿菌的單一菌落，置于干凈的玻片中央，加一滴3%雙氧水于菌落上，立即觀察有無氣泡出現。(7)脲酶試驗：用移液槍吸取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養物，接種至尿素生化管中，37 ℃培養24 h。(8)淀粉水解試驗：將枯草芽孢桿菌劃線接種于3%可溶性淀粉瓊脂平板上，37 ℃培養24 h。取出平板，在菌落處滴加少許碘液，觀察滴加碘液處的培養基顏色是否變藍。(9)硝酸鹽還原試驗：用移液槍吸取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養物，接種至硝酸鹽(還原)生化管中，37℃培養24 h。再分別滴加3～5滴VP甲液和VP乙液，若30 s內出現紅色即為陽性。若不變紅，加入少量的鋅渣然后變紅的為陰性。(10)明膠液化試驗：取枯草芽孢桿菌的純培養物，用接種針或接種環穿刺接種于明膠培養基中，22 ℃培養24 h。觀察培養基的液化狀態，觀察時，將其倒置，然后用手指輕輕彈動玻管，觀察是否有液體流動，有則為陽性，無則為陰性。

1.5.3 分子鑒定 (1)提取DNA：按照細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)(離心柱型)說明書操作。(2)PCR擴增：枯草芽孢桿菌的16s rRNA 擴增引物采用通用引物，正向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[8]。PCR反應體系(50 μL)：2×Es Taq MasterMix(Dye)， 25 μL；Forward Primer，10 um，2 μL；Reverse Primer，10 um，2 μL；Template DNA，2 μL；雙蒸水(ddH2O)，19 μL。以提取的DNA為模板，按以上PCR反應體系依次加入模板DNA和其他試劑，置于PCR儀中開始擴增。擴增條件為：預變性，94 ℃，2 min；變性，94 ℃，30 s；退火，55～65 ℃，30 s；延伸，72 ℃，30 s；25～35個循環；終延伸，72 ℃，2 min[9]。PCR反應產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)分子檢測：將以上試驗所得的疑似枯草芽孢桿菌送由生工生物工程(武漢)股份有限公司進行16s rRNA測序。(4)16s rRNA系統發育樹的構建及同源性分析：將所測得的16s rRNA序列用NCBI中的BLAST網站與GenBank數據庫進行同源性分析，運用MEGA 4 軟件進行序列同源性分析并制作系統發育樹[10]。

1.6 細菌的保存

配置50%濃度的甘油，高溫高壓滅菌后，按50%甘油：菌液為1:1的比例充分混合，先置于-20 ℃冰箱24 h，然后置于-80 ℃冰箱保存[11]。

1.7 枯草芽孢桿菌的篩選

1.7.1 牦牛源枯草芽孢桿菌的抑菌試驗 對復蘇的4株牦牛源枯草芽孢桿菌的12 h培養物進行3 500 r/min離心5 min。將指示菌大腸埃希菌(血清型為O111)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)復蘇，指示菌菌液濃度稀釋至1 cfu/L。分別取已稀釋好的大腸埃希菌(血清型為O111)菌液0.4 mL和金黃色葡萄球菌菌液0.4 mL，用滅菌的三角環均勻涂布在NA培養基上，用鑷子取出已被滅菌的牛津杯，輕輕放在已涂布過大腸桿菌O111菌液和金黃色葡萄球菌菌液的NA培養基上，每個培養基上放4只牛津杯，注意4只牛津杯的分布位置要均勻。然后將其放入4 ℃冰箱中，30 min后取出。分別吸取0. 25 mL離心后的Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7的上清液，然后分別注入4個牛津杯中，先將其放入4 ℃冰箱擴散24 h，然后接著將其放入37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察有無抑菌圈產生，用游標卡尺精準測量抑菌圈直徑。該試驗操作3次，取平均值。

1.7.2 人工腸液耐受性試驗 細菌復蘇后，離心收集菌體，用營養肉湯培養基重懸至108CFU/mL，加入1%的胰蛋白酶，37 ℃培養1 h，10倍倍比稀釋，涂布于選擇培養基，37 ℃培養24 h，采用平板稀釋法計數[12]。

1.7.3 豬膽鹽試驗 配制含有豬膽鹽溶液的選擇培養基，濃度分別為0.03 g/100 mL，0.10 g/100 mL，0.20 g/100 mL和0.30 g/100 mL。高溫高壓滅菌后，接種枯草芽孢桿菌的純培養物，37 ℃培養24 h，計算其存活率[13]。

1.7.4 高溫耐受性試驗 將枯草芽孢桿菌菌液分別置于85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃水浴鍋30 min，以室溫下未水浴加熱的為對照組。重復3次，計算其存活率[14]。

1.8 數據統計分析

試驗重復3次。所得試驗數據用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，試驗結果用“平均數±標準差”表示(P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著)。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的形態學鑒定結果

由圖1可以看出，培養基菌落形態為圓形或不規則，表面粗糙[15]，呈白色至黃色；革蘭氏染色為陽性；孔雀石綠染色芽孢呈綠色，菌體呈紅色；芽孢染色液染色菌體呈藍色，芽孢不著色。

圖1 枯草芽孢桿菌形態學鑒定A. 選擇培養基菌落形態;B. 革蘭氏染色(10×100);C. 孔雀石綠水溶液染色(10×100);D. 芽孢染色(10×100)Fig. 1 Morphological identification of Bacillus SubtilisA.colony morphology of selected medium;B. gram staining(10×100);C. staining with malachite green water solution(10×100);D. spore staining(10×100)

2.2 枯草芽孢桿菌的生化鑒定結果

4株分離株生理生化鑒定結果見表1。由表1可知，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等生化管與試驗菌株反應由紫色變為黃色，結果為陽性，過氧化氫酶試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗等結果均為陽性，與趙小琪等[16]的《豬源性芽孢桿菌的篩選與鑒定》結果一致，初步鑒定4株菌均屬于芽孢桿菌屬。芽孢位于菌體中央或次極端，形狀為橢圓形，淀粉水解、吲哚試驗、明膠水解、硝酸鹽還原、產氣、VP試驗、菊糖、甘露醇、蕈糖(海藻糖)、水楊苷等試驗結果，均符合《臨床微生物學手冊》，初步鑒定為枯草芽孢桿菌[17]。鑒定結果見表1。

2.3 枯草芽孢桿菌的分子鑒定結果

由圖2可見，基因組 DNA 瓊脂糖凝膠檢測結果，顯示試驗菌的PCR條帶在1 500 bp左右，與預期結果一致[18]。

西藏牦牛源枯草芽孢桿菌分離株16s rRNA系統進化分析見圖3。由圖3可知，10個序列的進化樹的進化距離為0.0020，說明各序列之間的同源性較近，包括10個序列的系統發育樹顯示1個分支。由圖4可知，Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7之間的同源性在98.4%～99.5%，試驗菌和數據庫的相關菌株的同源性均高于98.1%，且最高達到99.6%，其中Yak-KC7與標準株枯草芽孢桿菌(GU902972.1)處于較近位置。結合生理生化結果，鑒定Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7均為枯草芽孢桿菌。

表1 4株分離株生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification results of 4 isolates

圖2 基因組DNA瓊脂糖凝膠檢測結果 Fig. 2 Agarose gel test results of genomic DNA M. DNA Marker DL 2000；1. Yak-KC1，2. Yak-KC5；3. Yak-KC6；4. Yak-KC7

2.4 枯草芽孢桿菌的篩選結果

2.4.1 抑菌試驗 4株牦牛源枯草芽孢桿菌對大腸埃希氏菌(血清型為O111)和金黃色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同。對金黃色葡萄球菌，Yak-KC9的抑菌效果最佳，抑菌直徑最大達到26 mm；其次是Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC7，抑菌直徑分別達到(16±1)mm，(20±2)mm，(20±1)mm。對大腸埃希氏菌(血清型為O111)，Yak-KC9的抑菌效果最佳，抑菌直徑達到(25±1)mm；其次是Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC7，抑菌直徑分別達到(17±1)mm，(22±2)mm，(20±2)mm。Yak-KC9對金黃色葡萄球菌的抑菌效果極顯著高于Yak-KC1(P<0.01)，顯著高于Yak-KC7(P<0.05)，與Yak-KC5差異不顯著。對大腸埃希氏菌的抑菌效果，Yak-KC9極顯著高于Yak-KC1(P<0.01)，顯著高于Yak-KC1和Yak-KC5(P<0.05)。

圖4 西藏牦牛源枯草芽孢桿菌分離株(Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7)16s rRNA同源性分析Fig. 4 Homology analysis of 16s rRNA isolates of yak-derived Bacillus subtilis from Tibet (yak-kc1, yak-kc5, yak-kc6, yak-kc7)

2.4.2 人工腸液耐受性試驗結果 由表2可知，4個菌株在人工腸液環境下存活率達到74.5%以上，均有較好的人工腸液耐受能力(P>0.05)。同比，Yak-KC7的人工腸液耐受性最佳。

表2 4株枯草芽孢桿菌在人工腸液環境下的存活率Table 2 Survival rate of 4 Bacillus subtilis strains in artificial intestinal fluid environment %

2.4.3 豬膽鹽試驗試驗結果 由表3可知，隨膽鹽濃度上升，4株枯草芽孢桿菌的存活率下降，同比，豬膽鹽試驗中Yak-KC7的耐受性最佳。

表3 不同濃度豬膽鹽環境下枯草芽孢桿菌的存活率Table 3 Survival rate of Bacillus subtilis under different concentrations of pig bile salts[19]

2.4.4 高溫耐受試驗結果 由表4可知，菌株在85 ℃ 條件下存活率明顯高于100 ℃條件下的存活率，并隨著溫度的上升存活率下降明顯[20]，同比，Yak-KC7的高溫耐受性最佳。

表4 不同溫度下枯草芽孢桿菌的存活率Table 4 Survival rate of Bacillus subtilis at different temperatures

3 討 論

枯草芽孢桿菌能調解腸道菌群平衡，改善動物腸道的健康狀況，提高動物的生產性能，提高動物的免疫力，因為枯草芽孢桿菌特有的益生效果，能保護腸道黏膜組織，所以枯草芽孢桿菌是一種重要的腸道益生菌[21]。

本試驗中 ，從形態學鑒定及生化試驗結果均符合《臨床微生物學手冊》“表26-1芽孢桿菌屬、土壤芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬部分種的鑒別特征”中對枯草芽孢桿菌的特征鑒定。形狀為橢圓形或稍長，PCR擴增條帶位置在1 500 bp左右，16s rRNA測序同源性比較結果高達99.6%，鑒定為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌在動物體內發揮益生性的前提是必需具備良好的腸液、膽鹽耐受性；作為飼料中抗生素的優良替代益生菌的前提是，在飼料加工過程中接受高溫滅活處理后仍具備活性的能力[22]。本試驗設普通培養基為對照組，人工腸液、豬膽鹽、高溫處理培養基為試驗組。研究結果表明，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7在人工腸液環境下的存活率均超過75%；在豬膽鹽環境中的存活率隨豬膽鹽濃度的上升而下降，存活率范圍在49.8%～85.8%；在高溫環境下，隨溫度上升菌株存活率明顯下降，85 ℃的存活率顯著高于100 ℃的存活率，范圍在11.3%～90.6%之間。4個菌株均具有一定的腸液、膽鹽、高溫耐受性，Yak-KC7的耐受性最好。