始豐微型牛體型與外周血cAMP、PTH和TGF-β水平關(guān)聯(lián)性分析

冀德君 ，張 威，許 靜，程 牧

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.盱眙縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 淮安 211700)

始豐微型牛是我國(guó)浙江省地方品種天臺(tái)黃牛的一個(gè)小型類群。天臺(tái)黃牛分布在浙江省臺(tái)州市天臺(tái)縣及其周邊地區(qū)，其出生時(shí)體型小，當(dāng)?shù)厮追Q“小狗牛”，屬肉役兼用型的地方特色品種。黃牛體型大小的形成與遺傳特性、生長(zhǎng)激素軸、性軸等的調(diào)控有關(guān)[1]。生長(zhǎng)相關(guān)激素調(diào)控是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)，通過(guò)細(xì)胞合成與分泌激素物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，在不同的組織發(fā)揮相應(yīng)生理作用，從而對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育起調(diào)節(jié)作用。與體型大小形成最為密切相關(guān)的是骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，涉及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、甲狀旁腺素(PTH)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等因子。cAMP具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成，促進(jìn)激素分泌的作用[2]。一些二級(jí)促激素促進(jìn)次級(jí)激素合成是通過(guò)cAMP途徑調(diào)節(jié)的。cAMP能誘導(dǎo)GH的釋放，使代謝酶活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)肝臟內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA和RNA的合成[3]，并激活I(lǐng)GF1，促進(jìn)機(jī)體的合成代謝、增殖骨骼生長(zhǎng)和其他一些生物學(xué)的變化[4]，增快動(dòng)物的生長(zhǎng)速度。PTH是調(diào)節(jié)血鈣水平的最重要激素，它有升高血鈣和降低血磷含量的作用，其調(diào)節(jié)骨的合成、分解代謝，對(duì)骨形成和骨吸收具有雙重效應(yīng)，持續(xù)大劑量PTH 促進(jìn)骨吸收，間歇性小劑量PTH 促進(jìn)骨形成。另一方面，PTH對(duì)靶器官的作用是通過(guò)cAMP系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)的。PTH對(duì)骨樣細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，活化腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞cAMP濃度增加。在PTH作用下細(xì)胞cAMP含量升高是成骨細(xì)胞的典型表現(xiàn)之一[5-7]。Bllow等[8]認(rèn)為PTH 對(duì)鼠顱骨細(xì)胞的作用依賴于成骨母細(xì)胞分化的程度，PTH 刺激鼠顱骨細(xì)胞cAMP合成的高低與細(xì)胞的分化程度相一致。PTH刺激破骨細(xì)胞吸收骨基質(zhì)釋放TGF-β1，釋放的TGF-β1促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，從而增加骨形成[9]。TGF-β1在骨質(zhì)中大量存在，并由破骨細(xì)胞激活和釋放，是骨生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，也是體型大小形成的重要基礎(chǔ)。

本研究在普通體型天臺(tái)黃牛和始豐微型牛群體中，對(duì)骨骼生長(zhǎng)相關(guān)的cAMP等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析，以獲得始豐微型牛的基礎(chǔ)生理生化信息，并嘗試對(duì)始豐微型牛體型形成機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用的微型牛和較大體型天臺(tái)黃牛來(lái)自浙江省天臺(tái)縣天臺(tái)黃牛保種場(chǎng)，選取13～16月齡的健康始豐微型牛9頭(♀6♂3)和較大體型天臺(tái)黃牛9頭(♀6 ♂3)。

1.2 樣品采集與處理

早上空腹(禁食一晚，不禁水)，每頭牛無(wú)菌頸靜脈采血5 mL，加EDTA 抗凝，4 000轉(zhuǎn)/min離心，取上清，4 ℃保存，及時(shí)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析。

1.3 ELISA測(cè)定

針對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)因子cAMP、PTH和TGF-β，采用商用ELISA試劑盒(上海研瑾生物公司)進(jìn)行測(cè)定。首先稀釋ELISA試劑盒內(nèi)各標(biāo)準(zhǔn)品，在酶標(biāo)包被板上設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中準(zhǔn)確加樣50 μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL，倍比稀釋后輕微振蕩，封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。然后洗滌5次，拍干。接著加入HRP酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，重復(fù)溫育、洗滌步驟，最后加入底物溶液(TMB)50 μL，輕輕震蕩混勻，覆膜，37 ℃ 避光顯色15 min后，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀(Labsystems MultiskanMS-352，芬蘭)進(jìn)行450 nm波長(zhǎng)測(cè)量測(cè)定OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定數(shù)據(jù)，用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析不同體型組間三個(gè)指標(biāo)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 公牛不同體型間三個(gè)因子含量的比較

由圖1可知，微型牛組公牛TGF-β含量(185.9 ng/L)極顯著低于對(duì)照組(236.6 ng/L)(P<0.01)，cAMP含量(11.4 ng/L)顯著低于對(duì)照組(12.6 ng/L)(P<0.05)，甲狀旁腺素(PTH)含量?jī)山M間差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明促生長(zhǎng)相關(guān)因子水平對(duì)公牛體型大小的形成有影響。

圖1 公牛不同體型間三個(gè)因子含量的比較*表示差異顯著(P<0.05), **表示差異極顯著(P<0.01)Fig.1 Comparison of blood biochemical indice between miniature and normal body size of bulls* represents significant difference(P<0.05),** represents extremely significant difference(P<0.01)

2.2 母牛不同體型間三個(gè)因子含量的比較

由圖2可見，微型牛組母牛TGF-β含量(195.9 ng/L)顯著低于對(duì)照組(226.0 ng/L)(P<0.05)，其cAMP含量(13.97 ng/L)和甲狀旁腺素(PTH)(209.23 ng/L)含量和對(duì)照組(cAMP 13.52 ng/L；PTH 191.47 ng/L)間差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明雌激素等性別相關(guān)因素可能干擾促生長(zhǎng)相關(guān)因子的水平，進(jìn)而一定程度上影響了母牛生長(zhǎng)發(fā)育。

圖2 母牛不同體型間三個(gè)因子含量的比較*表示二者差異顯著(P<0.05)Fig.2 Comparison of blood biochemical indice between miniature and normal body size of heifers* represents significant difference(P<0.05)

2.3 不分性別不同體型間三個(gè)因子含量的比較

不分性別微型牛組TGF-β含量(192.6 ng/L)極顯著低于對(duì)照組(229.5 ng/L)(P<0.01)(圖3)，其cAMP含量(13.1 ng/L)和甲狀旁腺素(PTH)(205.8 ng/L)含量和對(duì)照組(cAMP 13.2 ng/L；PTH 203.8 ng/L)間差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明不同體型群體在遺傳上存在差異的TGF-β水平，可能是導(dǎo)致不同體型分化生長(zhǎng)結(jié)果的起因。

圖3 不分性別下不同體型間三個(gè)因子含量比較**表示二者差異極顯著(P<0.01)Fig.3 Comparison of blood biochemical indice of different genders with different body size** represents extremely significant difference(P<0.01)

3 討 論

正常的生理生化指標(biāo)，既能反映動(dòng)物體內(nèi)實(shí)質(zhì)與外表性能之間的關(guān)系，也能反映品種、性別、年齡、地區(qū)、不同外界環(huán)境及不同生理狀況的特征[10]，有必要將血液生理生化指標(biāo)的變化與生態(tài)環(huán)境、生產(chǎn)性能充分結(jié)合開展研究。甲狀旁腺激素(PTH)主要的作用是維持血鈣平衡，而血鈣濃度反過(guò)來(lái)又可以調(diào)節(jié) PTH 的分泌，在組織中表達(dá)使得cAMP含量升高。另外，PTH 也可以通過(guò)調(diào)節(jié)骨生長(zhǎng)因子(如 IGF-1)和生長(zhǎng)因子抑制劑等來(lái)間接地調(diào)節(jié)骨的生長(zhǎng)，如 PTH 可以通過(guò)誘導(dǎo) IGF-1 與成骨細(xì)胞結(jié)合達(dá)到促骨形成的作用[11-12]，其中cAMP是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學(xué)功能的重要物質(zhì)，是生命信息傳遞的“第二信使”。甲狀旁腺素(PTH)是由甲狀腺主細(xì)胞分泌的一種84肽激素[13]，是調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的主要生物活性物質(zhì)，可促進(jìn)骨鈣代謝、小腸對(duì)鈣的吸收[14]及遠(yuǎn)曲小管對(duì)鈣的重吸收，使血鈣升高，同時(shí)抑制近曲小管對(duì)磷和碳酸氫鈉的重吸收，使尿磷排出量增多，血磷下降。其分泌量增加，會(huì)使血鈣濃度上升，從而促進(jìn)骨形成和骨吸收，完成增加骨量[15-16]。Ferrari等[17]認(rèn)為，β-Arrestins可能通過(guò)限制PTH誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，限定了間歇性的PTH對(duì)骨骼的活性；另一方面，Arrestins可激活磷酸二酯酶，促進(jìn)cAMP的降解，通過(guò)cAMP/PKA調(diào)節(jié)PTH成骨作用。TGF-β在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用，可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化以及破骨細(xì)胞的活性。而PTH則通過(guò)PKC通路調(diào)控TGF-β1的表達(dá)以及通過(guò)PKA通路調(diào)控TGF-β2的表達(dá)[18]，PTH刺激破骨細(xì)胞吸收骨基質(zhì)釋放TGF-β1，釋放的TGF-β1促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，從而增加骨形成[19]。PTH-Smad3通過(guò)抗凋亡作用來(lái)擴(kuò)大TGF-β對(duì)成骨細(xì)胞的合成代謝效應(yīng)，提示TGF-β 信號(hào)與PTH信號(hào)存在相互作用[20]。

本文研究的始豐微型牛，系經(jīng)長(zhǎng)期自然選擇和人工選育而形成的山地型小個(gè)體黃牛，是一個(gè)肉役兼用型地方品種。通過(guò)研究始豐微型牛的三項(xiàng)生化指標(biāo)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、甲狀旁腺素(PTH)、與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)，并對(duì)其進(jìn)行分組比較分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)在微型牛和正常體型黃牛間存在顯著差異，結(jié)果說(shuō)明了TGF-β在體型形成中發(fā)揮著重要影響。由于本研究只涉及單個(gè)牛品種且樣本量較小，因此結(jié)果不能完全反映三個(gè)指標(biāo)在不同體型群體中的實(shí)際差異情況，特別是cAMP和PTH，很可能存在性激素和營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等因素的干擾，使得cAMP和PTH在遺傳上的差異不能體現(xiàn)。總體而言，始豐微型牛的體型和早期低水平促生長(zhǎng)相關(guān)激素有直接關(guān)系，深入研究將會(huì)揭示始豐微型牛生長(zhǎng)受阻的具體機(jī)制，為進(jìn)一步的深入研究揭示始豐微型牛的生物學(xué)特性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及背景資料。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，TGF-β在微型牛體型形成中發(fā)揮著重要影響，cAMP含量在公母牛上的影響有差異。