畜禽養殖場抗生素耐藥基因殘留及傳播研究進展

陳穎欣，陳佳華，張志瑾，馮錦濤，梅 亮，王 燕

(華南農業大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642)

自21世紀初起，世界衛生組織(World health organization，WHO)將抗生素耐藥基因(ARGs)定義為一種新型的環境污染物[1]。據統計，歐盟每年因感染攜帶多重ARGs的細菌而死亡的人數多達25 000人，而美國每年多達23 000人[2]。由于集約化畜牧養殖業與飼料業的發展，獸用抗生素廣泛應用于畜牧養殖業，2013年中國抗生素使用量高達16.2×104t，約占世界總用量的一半，其中52%為獸用，且有逐年增長的趨勢[3]。抗生素在動物體內不能被完全吸收代謝，約40%～90%以原藥或異構體的形式隨畜禽糞尿排出體外[4]。這些抗生素進入環境后會對環境生物構成威脅，加速環境中ARGs的產生和傳播。研究表明，養殖場及周邊環境采集樣本可檢出上百種ARGs，其中部分表達水平甚至是對照樣本的上萬倍[5]。因此，畜禽養殖場ARGs受到越來越廣泛的關注。本文在總結目前養殖場抗生素ARGs的種類及來源的基礎上，綜述了養殖場獸用抗生素ARGs的殘留以及擴散規律，并闡明了影響獸用抗生素傳播的相關影響因子，為減少養殖場的ARGs傳播提供數據支撐。

1 畜禽養殖場ARGs種類及來源

1.1 畜禽養殖場ARGs的種類

目前，研究發現的畜禽養殖場ARGs種類繁多。按耐藥種類劃分，主要有四環素類、磺胺類、大環內酯類、β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、氯霉素類等[6-7]。四環素類ARGs是國內外研究較多，已發現種類達四十多種的一類ARGs，主要包括金霉素、土霉素、四環素等。磺胺類ARGs不僅是ARGs中在養殖場普遍檢出的，而且是性質上較為特別的一類——若細菌對一種磺胺類抗生素產生抗藥性，則其具有所有該類抗生素的耐藥性[8]，主要包括磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等。

不同類ARGs其抗生素失活機制不同，同類ARGs也會存在不同的抗生素失活機制。按ARGs的耐藥機制，ARGs種類主要有抗生素酶解作用機制、核糖體保護蛋白機制、降低細胞膜通透性機制、外排泵機制、藥物靶標位點突變機制及其他或未知機制[2，9-10]：抗生素酶解機制是一類鈍化或滅活抗生素酶的基因，如四環素類酶修飾基因tetX[8]。核糖體保護蛋白機制以核糖體保護蛋白結合核糖體導致核糖體構型的改變，該過程由三磷酸鳥苷(GTP)水解提供能量，如tetM、tetO、tetS、tetT、tetQ等[2]；降低細胞膜通透性機制可以通過對細胞外膜脂質 A 進行氨基阿拉伯糖修飾，例如mcr-1等[11]；或選擇性地減少外膜孔蛋白的數量、改變外膜孔蛋白的大小、增加細胞壁的厚度，來降低自身細胞膜的通透性，使得抗生素無法通過菌體的外膜，從而導致細菌對某些抗生素產生抗性[2，12]；外排泵機理包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetG等，則通過存在于細胞膜上的一類蛋白將抗生素泵出胞外而產生耐藥作用，被認為是微生物適應環境脅迫條件的主要途徑[13]；藥物靶標位點突變機制的細菌體內存在許多與抗生素結合的靶標位點，不同種類抗生素的作用靶點不同，細菌可以通過改變相應的作用靶點，使抗生素與細菌不易結合而產生耐藥性，如細菌可以通過改變β-內酰胺類藥物的作用位點——細菌的青霉素結合蛋白(PBP)，使得β-內酰胺類抗生素不能與之結合從而實現對β-內酰胺類抗生素的耐藥等[14]；還有多種其他或未知機制，如tetU、ortC等。其中，酶解作用機制和外排泵機制是養殖場土壤中ARGs的主要耐藥機制[2，10，15]。另外，除單一耐藥類和單一耐藥機制的ARGs，還有倍受關注且多為臨床所見的對多重抗生素耐藥或具多重耐藥機制的的ARGs，其具有更高的多樣性及更大的防治難度。如編碼產超廣譜β-內酰胺酶 (Extend-spectrum-β-lactamases, ESBLs)的基因大多在一個較大的質粒上,該質粒常攜帶ARGs,因此ESBLs的菌株多數為多重耐藥菌[16]；程建華等[17]在紫色土丘陵區三種養殖場土壤中檢出各類型ARGs中，ARGs的豐度最高，達6.04×107～1.15×109copies/g。總而言之，目前發現的ARGs極富多樣性，而且仍有不少ARGs其失活機制仍待進一步研究。

1.2 畜禽養殖場ARGs的來源

畜禽養殖場抗生素ARGs的產生一般來自兩個方面。一是天然存在的ARGs，這主要是由于某些微生物在產生抗生素的同時也具有相應的耐藥機制[18]，使得環境中存在著天然的ARGs[19]。另一種來源是基因突變。研究人員認為抗生素過量使用產生了選擇壓，加劇了對ARGs的選擇，并促進ARGs的富集，讓許多原本不具備ARGs的微生物獲得了新的ARGs。

養殖場建址的自然環境中存在天然的ARGs，這些基因早在人類使用抗生素之前便已出現。有研究報道表明，β-內酰胺類、四環素類、糖肽類等ARGs在人類使用抗生素之前就在自然環境中存在[19]。同時，養殖場內飼養的畜禽體內的微生物也可能攜帶ARGs，Thames等[20]在從未攝入抗生素小牛的糞便中檢測出四環素相關ARGs。有研究者猜測環境中存在的原始ARGs可能來自產抗生素的細菌，并進一步分析發現，產抗生素細菌的原始ARGs最初發揮著非耐藥功能，如一些細菌ARGs表達的β-內酰胺酶最初用于參與肽聚糖的修飾[21]。研究人員曾在未經人為因素干預的土壤和沉積樣品中發現并提取出具有天然的ARGs的微生物[21]，依靠宏基因組學相關技術，發現了獨特的ARGs庫，有ARGs的前體基因[22]。自然條件下多數ARGs處于隱形狀態，但適當的環境壓力可使前體基因進化為ARGs，抗體基因也可能在特殊條件下表達。

抗生素的使用，促進了對第二種來源——基因突變產生的ARGs的選擇。抗生素含量水平可對動物腸道和糞便中的細菌ARGs產生一定的選擇壓力[23]，同一水平的選擇壓可能同時誘導多種ARGs富集，當選擇壓較高時，還可在短期內促進細菌形成新品種。研究表明,用金霉素飼喂肉牛會導致糞便中E.coli和腸球菌的耐藥率明顯增加[18]。在仔豬飼養中，口服與注射氨芐西林(20 mg/kg body weight)會顯著提高糞便中腸桿菌科細菌耐藥性，口服抗生素會使糞便中blaTEM拷貝數從104～106copies/g升高至107～109copies/g，耐藥率從0.9%～12%提高至40%，而注射抗生素的耐藥率則會升高至26%，但注射對糞便中的ARGs無明顯影響[24]。

2 養殖場ARGs殘留現狀

2.1 養殖場糞便中的ARGs殘留

糞便是養殖環境中ARGs的主要蓄積庫。研究表明，在畜禽養殖中添加亞劑量水平的抗生素會增加糞便中抗生素殘留和ARGs豐度[25]。磺胺類ARGs和四環素類ARGs在糞便中較常被檢測到。Xu等[26]分別從上海研究區代表性豬場、禽舍和養牛場進行糞便取樣，結果顯示在所有糞便樣品中均檢測到了磺胺類(sul1,sul2,sul3和sulA)和四環素ARGs(tetB(P),tetM,tetO,tetW)，磺胺類ARGs相對豐度呈以下趨勢sulA>sul1 >sul2 >sul3，四環素類耐藥基因的趨勢為tetM>tetW>tetO>tetB(P)。此外，關于氯霉素類ARGs和大環內酯類ARGs等也較常在糞便中被檢測到，何良英等[18]選取華南6個山地放養型雞場，5個室內平養型雞場進行糞便取樣，對常見ARGs進行檢測，其中5個氯霉素類ARGs(fexA、fexB、cfr、cmlA、floR)、4個四環素類ARGs(tetM、tetQ、tetS、tetW)和2個磺胺類ARGs(sul1、sul2)在所有糞便樣品中均被陽性檢出，檢出率較高的ARGs為fexA、cfr、cmlA、sul1和sul2，其次為fexB、floR、tetO。劉菲[27]對常州市2處肉雞飼養區域進行取樣，其中所研究的6類21種ARGs在糞便樣品中均有分布，測得磺胺類ARGs、大環內酯類ARGs、四環素類ARGs的絕對豐度分別為2.29×106～3.37×1011copies/g、2.05×105～2.16×1010copies/g、1.14×104～2.23×1010copies/g。

2.2 養殖場空氣中的ARGs殘留

在養殖場空氣中，四環素類、磺胺類、大環內酯類、β-內酰胺類和喹諾酮類等ARGs都曾被研究學者檢測到。金明蘭等[28]對吉林省某8家養殖場進行空氣取樣，共分離360株E．coli，通過PCR方法對選取的磺胺類ARGs(sul1、sul2、sul3)進行檢測，共檢測到163個ARGs，其中sul1、和sul2檢出率較高。高敏等[29]研究表明，雞場空氣中四環素類ARGs濃度較高。劉長利等[30]對某養豬場空氣大環內酯類ARGs(ermA、ermB、ermF)和四環素類ARGs(tetW)進行檢測，測得大部分目的基因濃度為104～107copies/m3，其中ermB、ermF、tetW濃度較高，為106～107copies/m3。

2.3 養殖場土壤中的ARGs殘留

大量養殖場ARGs隨著施肥等人類活動進入土壤。李曉華[23]選擇12個省的13家規模化生豬養殖場周邊進行土壤收集，通過熒光定量PCR技術對4類17種常見ARGs進行檢測，除ermB、qnrA、qnrB三種基因外，其他ARGs在土壤樣品中的檢測率為100%，土壤中tetA、tetX、tetG、sul1、ereA和qnrB等ARGs豐度值較高。Zhao等[31]對河南地區養豬場土壤環境中氟苯尼考類ARGs進行研究，發現氟苯尼考類ARGs整體污染水平較高，其中fexA、optrA和floR在所有的樣品中均被檢測到，floR平均相對豐度最高，其次是optrA。Mu等[32]對北方多個養殖場進行土壤取樣，對四類常見ARGs進行檢測，21種ARGs在大多數樣品中都被檢測到，其中大環內酯類ARGs(ermB、ermC)、磺胺類ARGs(sul1、sul2)、喹諾酮類ARGs(qnrS、oqxB)和四個四環素類核糖體保護蛋白ARGs(tetO、tetQ、tetM、tetW)在所有樣品中均被檢測到，在土壤中含量最多的是sul1和sul2，分別為(2.21±1.34)×10 copies/g和(1.01±0.56)×10 copies/g。

2.4 養殖場養殖廢水的ARGs殘留

Tao等[33]在6個豬場廢水處理系統中，tetA、tetW、sul1、sul2、blaTEM在所有樣品中均被檢測到，且磺胺類ARGs平均相對豐度最高，其次是blaTEM，四環素類最低。李晴等[34]對養殖場附近污水處理廠進行水樣采集，對分離所得的產ESBL大腸桿菌(escherichiacoli,E.coli)進行ARGs檢測，檢測到blaCTX-M、blaSHV、blaTEM等ARGs，其中blaTEM檢出率為100%。何良英[18]研究發現，雞場廢水中的優勢基因有fexA、floR、sul1、sul2和tetG，而豬場廢水中的優勢基因有tetA、tetH、ermE、sul2、sul1、tetG、fexA、ermB、tetO、tetW。

3 畜禽養殖場ARGs擴散與傳播

3.1 養殖場ARGs的擴散途徑

ARGs在某些條件可穩定存在并擴散，微生物是ARGs擴散的載體，廣泛存在于畜禽體內及外部環境中。畜禽體內微生物攜帶的ARGs通過糞污排放進入周圍環境中并得以進一步擴散(圖1)。ARGs在養殖場及周邊環境中主要有三個擴散途徑，分別為通過空氣及接觸擴散、糞污還田進入土壤、滲透作用進入地下水。

圖1 養殖場ARGs傳播途徑[24，36-37]Fig. 1 Dissemination of ARGs in the livestock farm

研究發現，養殖場細菌種類多為環境正常菌群及條件性病原菌，其中存在較多對青霉素類、喹諾酮類、磺胺類、氨基糖苷類等人畜共用抗生素耐藥的菌株[37]，其來源主要是畜禽糞便排放后，腸道內的微生物會負載到細顆粒物(particulate matter,PM)形成細菌氣溶膠并通過空氣擴散。另一方面養殖場工作人員暴露在空氣中，直接接觸了空氣中可能攜帶ARGs的微生物，ARGs得以向外界擴散或者進入人體引發疾病。

糞便中攜帶ARGs的微生物可隨著糞便還田進入土壤，并在土壤中進一步遷移擴散。Muziasari等[38]發現魚類養殖場沉積物中富集ARGs，并在魚的腸道中檢測出28種ARGs，猜測動物的糞便能促使ARGs在周圍環境中擴散。長期施用雞糞的土壤中檢出ARGs種類比對照土壤中ARGs種類更多[39]。Peng等[40]研究發現，在長期施用豬糞的土壤中檢出25種ARGs，而在所施用的糞肥中檢出ARGs有32種。研究說明養殖動物體內的ARGs會隨著糞便還田進入土壤，造成ARGs污染的進一步擴散。

隨著養殖污水排放至江河中，ARGs借此擴散到水體，下滲進入地下水。在養豬場納污河流中，出水點檢測出高水平多樣化的ARGs，說明養殖污水排放后，其中攜帶的ARGs進入新環境會促進其變遷[18]。動物排泄物隨廢水進入水體中造成抗生素的擴散，并進一步誘導ARGs發生變異(表1)。更為嚴重的是，ARGs可能隨著下滲的地下水，進入人類的飲用水中。已有多個國家報道, 包括自來水、再生水、地表水等，在多種水體均能不同程度地檢測出耐藥菌和ARGs污染[41-42]。研究檢測發現，天津市自來水中存在存在抗四環素類、β內酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類四類抗生素的ARGs[43]。可見ARGs可能會通過自來水等途徑向人類傳播，引起的健康安全隱患不容忽視。

表1 四環素類抗生素及ARGs相關度分析結果[44]Table 1 Correlation analysis on Tetracycline antibiotics and ARGs

3.2 養殖場ARGs的傳播方式

微生物ARGs的傳播分為兩個途徑，垂直轉移和水平轉移。某些細菌的染色質內存在天然的ARGs，微生物在增殖過程中染色質固有ARGs得到復制而世代傳遞，稱之為垂直轉移(vertical gene transfer, VGT)。通過調查山東肉雞場中分離的大腸桿菌耐藥譜及脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)，對比PFGE與ST型均相同的菌株，發現菌株既有同年份同地區同養殖場的，也有不同年份的，說明大腸桿菌分離菌株存在垂直轉移和水平轉移[45]。

另一方面，在環境中抗生素的壓力下，微生物利用各類移動元件(mobile genetic element，MGE)如整合子(integrons，In)、質粒、轉座子(transposons，Tn)等的接合轉移、轉導及轉化等方式來獲取環境中的ARGs[46]，稱為基因的水平轉移(horizontal gene transfer，HGT)。

VGT只能使ARGs通過母傳子的方式在同種屬微生物中世代傳遞，而HGT則能實現不同菌屬之間ARGs的擴散與交流。HGT主要依靠各類移動元件在微生物之間、環境與微生物間傳遞基因，而在人類活動的影響下，促進MGE的出現，加劇了HGT，導致ARGs擴散交流并出現了多重耐藥菌株。

HGT依靠各類移動元件如耐藥性質粒、In、Tn、整合性MGE和基因島等，通過轉化，接合、轉導的方式傳遞基因。

耐藥性質粒又稱R質粒，其組成單元之一的耐藥性決定因子賦予細菌特定抗生素的耐藥性[47]。R質粒能夠攜帶In、Tn來收集捕獲環境中的ARGs[47]，累積ARGs并通過轉化、接合、轉導、轉座或移位等轉移方式使多種ARGs共同傳播[48]。臨床中常見的革蘭氏陰性菌對磺胺類藥物ARGs多是質粒攜帶ARGs而導致的獲得性耐藥[18]。Tn是可從細菌基因組上一個位點插入到另一個位點上的遺傳因子，有些Tn會攜帶ARGs，在基因間躍遷的過程中實現ARGs的轉移[48]，其轉座過程是Tn的一個拷貝仍留在原位點，新的拷貝插入在“靶點”上，新型Tn-554家族轉座子Tn-6674攜帶了spc、erm(A)等多個ARGs[49]。利用轉座子遺傳標記基因，在耐藥大腸埃希菌中tnp513檢出率為75%，試驗證明ARGs被檢出在或者質粒(fex-B、cml-A、cfr、flo-R)等移動元件上[49]。

In通過編碼整合酶來捕獲細胞外的游離基因并整合到基因盒子(gene cassettes，GCs)中，攜帶GCs插入到其他可移動元件在細菌間傳播ARGs，并可為游離基因提供啟動子使其在細胞內表達[50]。轉移方式為轉化、轉導、接合等。何良英等[18]試驗結果表明，肉雞養殖場及其受納環境中ARGs的擴散與In相關。

此外，如整合性結合元件(integrative and conjugative element，ICE)、基因島(genomic island， GEI)等新的基因水平轉移元件在ARGs的水平轉移中發揮著重要作用。由于自然界生物細胞的裂解釋放，攜帶ARGs的裸露DNA分子在一定條件下可在環境中持續存在[51]，特定條件下環境中細菌之間發生基因水平轉移，細菌通過吸收游離的DNA分子獲得ARGs[51]。Heather等[12]研究表明攜帶了ARGs的MGE能轉移到人類的共生菌與致病菌中，對人類造成威脅。

4 ARGs擴散和傳播影響因素

4.1 光照

在黑暗條件下有利于抗生素傳播，ARGs與宿主細胞很難發生光解，研究人員利用實時定量PCR技術在實驗室模擬監測了編碼四環素的ARGs(tetO、tetW、tetM、tetQ)以及宿主細菌在水中的歸趨，結果光照處理組ARGs的一級消減系數(kd)為-0.75至-0.84 d，黑暗處理組ARGs的一級kd為-0.49 d。Knapp等[52]2008年利用中宇宙的方法發現四環素ARGs(tetO、tetW、tetM、tetQ、tetB、tetL)在光照處理下kd為-0.72 d，黑暗處理下kd為-0.51 d，最終發現黑暗處理下ARGs的kd值顯著大于正常光照處理下的kd值。Kd值增大，ARGs含量減少，能傳播的ARGs因此也減少。

4.2 溫度

在高溫條件下不利于抗生素傳播， ARGs降解速度會加快。 Pei等[53]在研究牛奶廠廢水中ARGs對于生物處理的反應中發現，兩種四環素ARGs(tetW、tetO)兩種磺胺類ARGs(sul1、sul2)在20 ℃處理后的含量顯著小于4 ℃處理后的含量。ARGs含量減少就能降低ARGs傳播的可能性。潘尋等對高溫堆肥中不同溫度處理的四種抗生素( 磺胺二甲嘧啶、土霉素、金霉素、泰妙菌素)定量分析，研究發現高溫堆肥能有效去除抗生素[54]。四種抗生素中，最高溫度為43和68 ℃處理28 d堆肥結束時，磺胺二甲嘧啶去除率增加2%，土霉素去除率增加13%，金霉素去除率增加8%，泰妙菌素去除率增加14%。 抗生素濫用是導致ARGs產生的原因，一旦抗生素去除，畜牧場內外環境微生物菌體和畜牧體內微生物菌體產生ARGs的可能性減少。

4.3 氧氣

在厭氧條件下ARGs降解速度加快。Pei等[53]研究發現，四環素ARGs(tetW、tetO)與磺胺類ARGs(sul1、sul2)在厭氧處理后的含量顯著小于4 ℃處理后的含量。ARGs含量減少就能降低ARGs傳播的可能性。

4.4 重金屬

重金屬可以影響ARGs的傳播。重金屬與抗生素的組合作用一共有三種情況[55]。(1)低濃度的重金屬與抗生素為協同抗性，高濃度重金屬與抗生素為協調殺菌。如Cr6+和Zn2+與紅霉素的作用;(2)與1相反，高濃度的重金屬與抗生素為協同抗性，低濃度重金屬與抗生素為協調殺菌。如Cr6+和Zn2+與阿莫西林的作用;(3)只與共存重金屬種類有關。如Cu2+的共存導致菌體的四環素抗性減弱，類似情況還有Cu2+與阿莫西林，Cr6+與頭孢，敏感性從耐藥變成敏感，而Cu2+的共存導致菌體的紅霉素抗性明顯增強，敏感性從中介變成耐藥。李曉華[23]研究表明，糞便、土壤和污水中的ARGs和抗生素水平并不存在明顯的線性相關關系，這表明除抗生素誘導外，土壤中還存在其他因素影響ARGs的擴散傳遞。已有研究表明，土壤中重金屬含量與抗生素可對ARGs產生共同選擇效應[24]。Zhu等[56]發現，土壤中ARGs濃度與重金屬含量成正相關。故猜測抗生素濃度及重金屬含量等因素共同作用影響ARGs在土壤中傳播。另外，土壤的常規理化性質也可能對ARGs起共同選擇作用，但詳細機理還有待研究。

4.5 環境介質

不同的環境介質也會影響抗生素的傳播，從而誘導不同的ARGs，也會直接影響ARGs的傳播。磺胺類和氟喹諾酮類是水介質中最常殘留的抗生素，沉積物和土壤也常殘留著四環素、磺胺類和大環內脂類抗生素等[57]。在空氣中，細菌氣溶膠化的程度會影響空氣介質中ARGs的豐度[58]。Gao等[59]分別研究了蛋雞及肉雞養殖場空氣中的四環素類ARGs，對比發現兩種養殖場中ARGs豐度都與PM的直徑成正相關。調查顯示，在養殖場周邊環境中，比起上風向測定的PM相比，下風向中PM包含的四環素類ARGs更為豐富，說明AGRs在養殖場周邊的擴散受風向影響。

5 展 望

養殖場ARGs的出現及廣泛傳播，使得各類微生物耐藥率不斷提高，耐藥譜擴大，導致各類抗生素的作用明顯減弱。畜禽糞便與廢水是ARGs的重要蓄積庫，畜禽糞便與廢水中的ARGs不僅可進行水平轉移，而且具有垂直傳播功能。對糞便廢水的充分處理或資源化利用，使耐藥菌和ARGs滅活，有效減少甚至避免養殖場ARGs的擴散，也是今后研究的方向。總之，對于ARGs的種類、來源、傳播及影響因素的研究在國內的研究仍待深入，其能有效幫助對ARGs的整治，促進畜牧行業的健康發展，保障畜牧產品在生活中的安全使用。