MDMPR：小鼠發育代謝表型庫

朱文靜，劉志瑋

資源與平臺

MDMPR：小鼠發育代謝表型庫

朱文靜，劉志瑋

蘇州大學，劍橋–蘇大基因組資源中心，蘇州 215123

小鼠發育代謝表型庫(Mouse Developmental and Metabolic Phenotype Repository, MDMPR)是一個致力于小鼠資源和表型數據實時共享的開放性平臺，它依托于科技部重點研發計劃“發育編程及其代謝調節”專項項目“建立小鼠發育代謝表型庫”。該項目預計在5年內完成500個發育代謝相關小鼠敲除模型的建立，并對其表型數據進行標準化的解析、建立表型數據庫。MDMPR作為一個資源及數據集成的庫，由多個子系統作為支撐，包括ES細胞數據庫、項目管理系統、繁育管理系統、精子庫管理系統、表型分析系統，信息化管理深入到項目中每個環節，從基因突變ES細胞制備、基因突變小鼠制備、小鼠繁育，精子凍存到最終的表型分析、數據處理及展示，保證了MDMPR產生數據的真實性及實時性。MDMPR除了不斷地推進項目進行，增加自身產生的數據外，也在積極的整合其他的資源及數據，如人特異性基因敲除ES細胞庫、蛋白相互作用數據庫(STRING)、核心轉錄調節環路(dbCoRc)和Enhancer-Indel數據庫，今后還將進一步整合，幫助發育代謝及其他領域的研究人員能夠一站式的獲取所需資源和數據、加快研究進程，最終服務于全人類的醫療事業。

小鼠發育代謝表型庫；資源庫；開放共享平臺

作為哺乳動物，小鼠()和人()的基因組同源性高達90%以上，在組織結構和功能、生理學穩態、生殖、行為和疾病發生機制等方面也高度相似。更重要的是，臨床疾病大多有其遺傳基礎，基因突變小鼠模型可以真實模擬人類基因組變異導致的疾病，是研究病理機制和發現潛在靶標的最佳模式動物。人類和小鼠基因組計劃完成后，美國、歐盟、加拿大、日本等批準了一系列重大工程項目，系統化建立基因突變小鼠模型，這些項目包括美國國立衛生院的小鼠基因敲除計劃(Knockout Mouse Project, KOMP)、歐盟第七框架的歐洲小鼠條件性敲除計劃(The European Conditional Mouse Mutagenesis Program，EUCOMM)，和加拿大的北美小鼠條件性敲除計劃(The North American Conditional Mouse Mutagenesis Project, NorCOMM)等，中國也有支撐計劃(如The Chinese Conditional Mouse Mutagenesis, ChiCOMM)[1~6]。隨著小鼠敲除模型的不斷積累，國際上成立了敲除小鼠聯盟(The International Knockout Mouse Consortium, IKMC)[7])。在2011年更是將單純制備基因修飾小鼠模型的IKMC聯盟，發展為系統性無偏見功能性解析小鼠表型的國際小鼠表型分析聯盟(International Mouse Phenotyping Consortium, IMPC)[8~11])。迄今為止，全球14個國家的25個研究機構參與了這個國際大科學計劃，雜志將該計劃和國際核聚變計劃、國際加速器計劃并列為三大國際大科學計劃，并指出系統分析基因功能對疾病解析及新藥開發將起到核心推動作用[12]。該計劃也是G7國家認可的生命科學領域最大的合作項目，受到領域內研究機構的空前重視。為實施該計劃，美國國立衛生院、歐盟、英國醫學研究理事會、加拿大衛生部、日本理化研究院及Wellcome Trust基金會都投入了大量經費，目前由現任NIH院長Francis Collins博士擔任IMPC領導者。

在我國，疾病模型研究和資源平臺建設在過去幾年也取得了長足的發展，依托國家遺傳工程小鼠資源庫等小鼠基因組改造技術平臺，科技部于2006年啟動了國家科技支撐計劃重點項目“人類重大疾病小鼠模型的建立與應用”，使得我國與世界同步開展了基因敲除計劃(ChiCOMM)，主要承擔方為南京大學模式動物研究所(Model Animal Research Center, Nanjing University, MARC)，也借此發展成為國內最大的遺傳突變小鼠資源庫。ChiCOMM形成了與國際對接的小鼠表型分析技術體系及相關技術標準，顯著推動了國內敲除小鼠模型的共享及開發。隨后在2014年，由蘇州大學和英國劍橋大學Sanger研究所共同成立了劍橋–蘇大基因組資源中心(Cambridge- Suda Genomic Resource Center, CAM-SU GRC)，一個隸屬于蘇州大學的校級研究機構。劍橋-蘇大基因組資源中心依托Sanger研究所提供的資源優勢，建立亞太地區的干細胞資源中心，同時建立小鼠標準化基因組功能解析平臺，從此成為一個提供小鼠突變胚胎干細胞、疾病模型以及基因功能解析技術的生物技術平臺。CAM-SU GRC同時成為繼英國、德國、美國后第4個小鼠突變干細胞資源中心，也是亞洲唯一的代表，負責亞太地區48個國家的資源分發工作。在多年的運行期間，劍橋–蘇大基因組資源中心已經向國內外上百個課題組提供了細胞及小鼠資源，極大地促進了研究的進展。在國際上，劍橋–蘇大基因組資源中心也與南京大學模式動物研究所一起在國際小鼠表型分析聯盟指導委員會成員中占得兩個席位，這不僅是我國對人類科學事業應盡的責任和義務，同時也是我國社會經濟發展的客觀需要。

緊跟國際生命科學研究的發展，科技部于2018年啟動了國家重點研發計劃“發育編程及其代謝調節”重點專項，提出需建立小鼠突變品系的發育與代謝特征的系統分析，對現有和新創建的小鼠突變品系的發育與代謝進行系統性分析，發現重要基因的新功能；建立和實時更新突變品系的表型數據，形成有效的數據共享網絡系統。在此背景下，由蘇州大學劍橋–蘇大基因組資源中心牽頭，南京大學模式動物研究所作為主要參與方，聯合復旦大學、中國科學院遺傳與發育生物學研究所、東華大學、軍事醫學科學院等單位申報并獲批了“建立小鼠發育代謝表型庫”項目，本項目的核心就是聯合并利用國內優勢資源和技術，在5年內建立不少于500個具有自主知識產權的小鼠品系及其發育、代謝表型的數據庫，同時重點開展小鼠表型數據與臨床特征之間的關聯研究，促進人類疾病遺傳基礎研究領域的變革型發展。小鼠發育代謝表型庫(Mouse Deve-lopmental and Metabolic Phenotype Repository, MDMPR)作為項目最為主要的成果展示，也于2020年底正式上線(小鼠發育代謝表型庫訪問地址：www.cam-su.org)，受到相關領域內人員極大的關注，隨著項目的進行，資源、表型數據的不斷豐富，必將極大的推進相關領域研究的進展。

1 國內外同類資源庫現狀

國外的同類數據庫起步較早，目前數據量較大，應用比較廣泛的數據庫有Mouse Genome Infor-matics (MGI, http://www.informatics.jax.org/)及Inter-national Mouse Phenotyping Consortium (IMPC, https://www.mousephenotype.org/)，各自有不同的側重點。MGI更關注于基因信息的整合，集成基因表達、功能注釋、蛋白信息、相關小鼠品系資源信息等，可以使用戶較全面的獲取基因相關信息，開展研究。IMPC更專注于發布自身項目的數據，包括細胞、小鼠及表型信息，是目前世界上表型信息最為全面的數據庫，并且基于其標準化的分析流程，能夠進行大數據層面的平行比較，將基因按照表型分類進行歸類，給從表型入手的研究者提供了一個非常好的入手點。

國內的此類數據庫起步較晚，而且大部分尚處在資源展示的階段，如國家遺傳工程小鼠資源庫(http://www.nrcmm.cn/)。另有很多的品系資源保存在商業化的公司內，如上海南方模式生物科技股份有限公司(https://www.modelorg.com/)、江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司(http://www.gempharmatech. com/cn/)和賽業生物(https://www.cyagen.com/cn/zh- cn/)，其商業化的運作模式對于資源開放共享方面存在著諸多的限制，不利于研究領域內的資源共享。此外，對于小鼠模型進行系統性的表型解析，并將數據全部開放，在國內尚處于空白階段。在科技部支持下建立的MDMPR，秉持資源開放共享的理念，對國內的研究領域是一個非常好的補充，也是緊跟國際發展趨勢的。

2 MDMPR項目基因選擇

小鼠中大約有20,000個基因，而在有限的項目經費支持下，我們只能完成約500個基因的小鼠制備以及功能解析，這樣對于目標基因的挑選提出了很大的挑戰性，怎么樣能從有限的數量中找到盡可能多的有改變的基因。因此，在項目啟動初期，我們也做了很多工作，首先利用國際公認權威的人類基因組元件、遠端轉錄調控數據庫進行比對整合獲得人類4D調控組數據庫，進一步與人類疾病相關基因組突變數據庫(Motif Break、Mutation Targeted Pair)及對應轉錄組數據進行關聯分析，得到存在潛在邏輯調控關系的人類疾病關聯基因數據庫，而后再根據GWAS對基因進行深層篩選和分類得到1000多個人類疾病相關的發育代謝相關基因。通過與小鼠基因組進行比對，結合國際表型分析聯盟的研究進展并與小鼠基因組進行比對從中深層篩選得到514個小鼠同源基因。另外也從國內的發育、代謝領域專家中征集了部分基因，共同構成MDMPR候選基因。項目進展至今，早期獲得的一些基因突變小鼠的初步表型數據也證實了我們篩選基因的方式是有效的，已經發現了數個控制小鼠存活的關鍵基因，并且是國際上尚未有相關報道的，相信隨著項目的深入進行，更多有意義的表型改變會出現。

3 MDMPR技術路線

3.1 標準化基因遺傳工程小鼠敲除策略

MDMPR同時采用了兩種不同的技術手段去建立基因遺傳工程小鼠，其中劍橋-蘇大基因組資源中心主要基于現有的突變小鼠胚胎干細胞資源(圖1)，南京大學模式動物研究所基于CRISPR/Cas9敲除技術(圖2)，分別建立基因敲除小鼠模型。

小鼠的遺傳背景和微生物級別是影響實驗結果的重要因素：不同遺傳背景的小鼠對同一個基因的改變可能呈現不同量甚至是不同質的反應；同樣，小鼠的微生物級別反映小鼠的生理健康狀態，其差異也會造成實驗結果的波動。對小鼠遺傳背景和微生物進行質量控制可以保證使用最少的實驗資源完成既定實驗目標，最大限度實現實驗效益。這部分工作主要包括：(1)小鼠模型制備過程中遺傳質控；(2)小鼠繁育過程中的遺傳質控；(3)小鼠繁育過程中的微生物質控。

在項目進行期間，依據現有實驗動物遺傳質量控制和微生物學等級的相應國標[13,14]，各單位根據實際情況制定規范，定期對小鼠的遺傳背景(C57BL/6)和微生物級別(無特定病原體動物)進行質控，保障了實驗動物的可靠性與實驗數據的可重復性。截止2020年11月，檢測結果見表1，CAM-SU GRC及MARC的微生物質控標準參見附表1及附表2。

3.2 標準化的發育、代謝表型分析流程

以“國際小鼠表型分析聯盟”的生理病理表型分析技術流程為基礎，本項目發展了重點針對代謝和發育功能的專有分析流程(圖3)。在交配獲得進入流程的實驗小鼠過程中，利用純和的雌性或雄性與雜合鼠進行交配，對其生殖能力進行評估；另外存活檢測作為一個重要的檢查點，決定該基因敲除小鼠品系是否會進入胚胎分析流程以及是用雜合還是純和敲除小鼠進行成體流程分析。

為了保證小鼠在表型分析流程中產生數據的一致性以及可重復性，所有的表型分析操作基于SOP (Standard Operating Procedure)來進行，采集的具體參數，包括實驗設置相關參數(metadata)以及具體實驗參數(parameter)的參數種類、數據類型、數值選項也通過SOP進行規范，從制度上保障了產生數據的可靠性(圖4)。目前已經建立了111個SOP、492個參數，隨著項目進行，SOP及參數數量還將進一步增加，MDMPR即是建立在這些基礎參數之上。

圖1 基于突變小鼠胚胎干細胞的敲除策略

“Knockout First” allele (tm1a)是在目的基因內含子中插入一個SA-IRES-reporter片段(含有報告基因lacZ和一個啟動子驅動的Neo)，lacZ的轉錄在SA的作用下受目的基因啟動子控制，并在polyA處終止，從而達到終止目的基因轉錄、破壞基因表達的目的。Flp的表達可以刪除SA-IRES-reporter片段，將tm1a轉變成條件敲除基因(tm1c)，從而恢復基因功能。在tm1a的基礎上，Cre的表達可以刪除Neo和critical region從而變成lacZ標記的allele (tm1b)同時敲除基因；在tm1c的基礎上，Cre的表達可以刪除tm1c allele上的critical region而變成移碼突變的tm1d，從而使該基因不表達。

圖2 基于CRISPR/Cas9的敲除策略

基于CRISPR/Cas9的敲除策略，針對目標外顯子兩側設計一對sgRNA，通過Cas9介導的同源重組方式將供體DNA(目標外顯子外側包含一對loxp序列及外側的同源臂)形成Flox基因，在Cre作用下能夠切除目標外顯子，造成基因敲除。該策略可能存在兩種副產物，其一是同源重組未能發生，造成目標外顯子缺失；另可能造成目標外顯子部分缺失，也可能引起frame-shift而造成基因敲除。

表1 遺傳背景和微生物級別質控情況匯總

CAM-SU GRC：劍橋–蘇大基因組資源中心；MARC：南京大學模式動物研究所。

4 MDMPR系統建設

4.1 MDMPR系統架構

建立的細胞、小鼠資源及表型數據通過數據庫進行存儲，進而通過網頁前端將信息通過合理的方式開放給公眾進行查詢及使用。盡管數據庫的目的在于存儲細胞、小鼠及表型的信息，但構建時并不僅僅局限于此，還包含了小鼠制備、繁育、品系保種等過程中相關的實驗記錄及數據。小鼠發育代謝表型庫是一個非常龐大的信息化系統，主要包括ES細胞數據庫、項目管理系統、繁育管理系統、精子庫管理系統及表型分析系統，各系統間信息互相交互，共同形成MDMPR中的對外展示信息。同時，為了更加方便用戶使用，我們在進行多個數據庫的整合工作，目前已經將蛋白相互作用數據庫(STRING)、核心專利調節環路(a database of Core transcriptional Regulatory Circuitries, dbCoRC)，Enhancer-Indel數據庫進行了整合，使用戶能夠獲取更多的關注基因的咨詢，將MDMPR發展成為一站式的小鼠信息資源數據庫(圖5)。

圖3 標準化的發育、代謝表型分析流程

圖4 實驗參數結構

4.2 MDMPR數據流

數據起始源頭來自于ES細胞數據庫，項目啟動，開始復蘇后，克隆信息進入項目管理系統，對復蘇狀態，QC結果進行記錄，相關克隆信息同時返回ES細胞數據庫；QC通過的克隆會進行注射，經項目管理系統記錄注射數據及嵌合鼠結果，產生的雄性嵌合鼠自動在繁育管理系統中生成，進入實際飼養管理中；飼養管理系統基于移動端開發，通過二維碼形成的地址訪問相對應的籠位、小鼠信息，常規的繁育操作如配繁、生仔報告、剪尾、分籠、處死均通過“動物管家”APP進行，確保了數據庫內存儲的活體信息是實時更新的；表型分析項目從繁育管理系統中實際存在的小鼠開始建立，通過建立標準化的分析流程，標準化的數據錄入格式，自動化的數據處理方式，保障了數據的真實性，排除人工帶入的誤差；品系經精子凍存后，凍存樣本信息導入精子庫管理系統，同時返回繁育管理系統，這樣共同構成品系的真實存儲狀況；MDMPR前端展示數據從各個系統中進行調用，共同構成展示部分(圖5)。

4.3 MDMPR前端展示界面設計

數據合理的展示方式實際是用戶最為關注的點，我們以使用者的角度，對MDMPR中來源于不同系統的數據有機組合，構成前端展示的界面，使用戶能夠在一個界面獲取到所需數據的概覽，如在檢索結果的主頁即能查看到細胞、小鼠、表型、相關數據庫的情況，第一時間掌握資源及數據的儲存情況；同時大量使用直觀的圖示，使用戶能夠在最短的時間內獲取到最為重要的信息，極大的提升了使用的體驗度；此外創造性的加入了關注功能，基于全部項目進度的信息化，能夠在關注基因狀態改變的同時自動化的向用戶推送信息，掌握第一手資訊(圖6)。

圖5 MDMPR系統架構

5 MDMPR應用實例

MDMPR除了對于單個基因的表型數據進行分析外，基于其數據量、產生數據方式帶來的平行可比性，可以對數據進行大規模的表型與基因關聯分析，篩選出關鍵基因。我們曾經成功的利用IMPC聯盟ICS、TCP、RBRC、WTSI四個中心的小鼠飲食和活動的數據作為模型訓練的數據初步開發了深度卷積神經網絡方法并對少數指標進行了表型篩選，篩選了10種飲食或者活動異常的基因型小鼠，并針對基因敲除小鼠進行了生物節律的深入表型驗證和分析，驗證了其在外界光照牽引小鼠晝夜節律中的作用，進一步的功能分析暗示其可能通過調控生物鐘核心SCN (Suprachiasmatic Nucleus)神經元之間的同步影響外界光照對晝夜節律的牽引，成果已發表在[15]。IMPC也已有多方面的嘗試，在大數據比較的基礎上找到了一些新的發育相關基因[9,16~18]。以此為例，在MDMPR數據廣度和深度的不斷充實下，可以通過類似的大規模表型與基因關聯分析，發掘出一些新的基因功能。

圖6 MDMPR前端頁面設計

6 結語與展望

MDMPR最主要的核心在于其資源與數據的開放共享，這在國內屬于創新性的嘗試，可以將國家的研究經費轉化出最大的價值，被更多的相關研究領域的人所利用。標準化的表型分析流程，信息化的流程及數據管理，保障了產生數據的真實性及及時性，能夠為研究者在項目起始階段提供初期實驗數據，對立項及研究方向提供指引，是研究者開展研究的一個利器。雖然MDMPR尚處在起步階段，資源及表型的數據尚在積累中，從數量上來說還不足，但隨著項目的不斷進展，更多的資源和數據將會加入，不斷充實表型庫，讓更多用戶能夠獲得有用信息，促進研究的進展。在系統架構上，我們也在不斷的進行優化，提升用戶在使用上的體驗，通過整合其他的數據庫，力爭將MDMPR建設成一站式的資源數據平臺。盡管項目投入有限，我們也將充分利用現有條件，通過技術手段的提升，壓縮成本，盡可能在完成項目目標的基礎上，增加更多的資源與數據。同時，我們也積極在國內外尋求合作的機會，招募有意愿的研究單位共同加入到此項目中，擴充研究的寬度，使資源的使用效率最大化。目前已有數家合作單位參與到項目中，承擔如痛覺、生殖、應激行為等方面的分析，進一步拓展了表型庫的覆蓋范圍，并且已經獲得了一些有意義的數據，數據庫也在同步準備中，將在不久后開放展示。相信在不久的將來，MDMPR將建設成為國內最大、最全、開放程度最高、實用性最強的資源庫，極大地推進代謝、發育甚至其他領域的研究進展。

致謝

感謝科技部重點研發計劃“發育編程及其代謝調節”重點專項“建立小鼠發育代謝表型庫”項目參與單位蘇州大學、南京大學、復旦大學、中國科學院遺傳與發育生物學研究所、東華大學、軍事醫學科學院的項目組成員對于此項目所付出的努力，感謝南京百邁斯信息科技有限公司在MDMPR數據庫建設中的全力支持。

附錄：

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

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附表1 CAM-SU GRC微生物質控標準

Supplementary Table 1 Microbiological quality control standards of CAM-SU GRC

附表2 MARC微生物質控標準

Supplementary Table 2 Microbiological quality control standards of MARC

MDMPR: Mouse Developmental and Metabolic Phenotype Repository

Wenjing Zhu, Zhiwei Liu

Mouse Developmental and Metabolic Phenotype Repository (MDMPR) is an open access, real-time database which dedicates to share mouse resources and phenotype data. MDMPR is supported by the National Key Research and Development Project “Establishment of Mouse Developmental and Metabolic Phenotype Repository” within the Key Project of “Developmental Programming and Its Metabolic Regulation” from the Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China’s program. In the next 5 years, MDMPR will create 500 mutant mouse models related to development and metabolism, perform standard phenotyping analysis, and establish a phenotype database. MDMPR is a combination of resources and data repository, has several sub-systems, including the ES cell database, the project management system, the breeding management system, the sperm bank management system and the phenotyping database. These systems digitalize all data and ensure their authenticity in real-time. Besides the gradual increase of data during the project, MDMPR will also integrate other resources, such as human KO ES cell database, STRING database, database of Core Transcriptional Regulatory Circuitries and Enhancer-Indel database. MDMPR is anticipated to contribute to various areas of developmental and metabolic research to investigators through more convenient accesses to the resources and data in one-stop manner, thereby accelerating the research processes and ultimately serving the medical causes of human health.

Mouse Development and Metabolic Phenotype Repository; resource repository; open-access sharing platform

2021-01-05;

2021-03-04

科技部重點研發計劃項目(編號：2018YFA0801100)資助[Supported by the National Key R&D Program of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2018YFA0801100)]

朱文靜，碩士，實驗技術員，研究方向：生物化學與分子生物學。E-mail: zhuwenjing@cam-su.org

劉志瑋，博士，研究方向：生物化學與分子生物學。E-mail: liuzhiwei@cam-su.org

10.16288/j.yczz.21-005

2021/3/16 11:31:37

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210315.0958.005.html

(責任編委: 陳帥)