檸檬烯-6-醇新戊酸酯水乳劑的抑菌活性研究*

陳紅兵，高晉融，王仟莉，王美琴，李 銳

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，山西 太谷 030801；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用，在保障農(nóng)作物高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)方面發(fā)揮了巨大的作用，目前是病蟲害防治的重要手段之一。在傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的長期使用過程中，不可避免的產(chǎn)生了農(nóng)藥抗性、害蟲再猖獗、化學(xué)殘留等一系列問題。因此，加快發(fā)展廣譜、低毒、高效、低化學(xué)殘留安全的農(nóng)藥越來越顯得重要。植物中有許多的生物活性化合物，這些生物活性化合物經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)對有害微生物具有殺菌的作用，在使用過程中對環(huán)境和人都表現(xiàn)出較低的毒性，在環(huán)境中容易降解，表現(xiàn)出低的殘留，從而產(chǎn)生對環(huán)境和人的危害影響達(dá)到最低的程度[1-4]。新戊酸酯類具有抗水解性和特定芳香氣味，可用作洗漱日用品中的香味添加劑，檸檬烯-6-醇新戊酸酯是金葉含笑植物中的精油成分之一，檸檬烯-6-醇新戊酸酯作為植物源殺菌水乳劑的研究未見有文獻(xiàn)報道[5-8]。農(nóng)藥水乳劑(EW)是一種農(nóng)藥水包油型(o/w)乳狀液，和傳統(tǒng)的農(nóng)藥乳油制劑比較，它在制造過程中成本較低，使用也非常安全，另外在運(yùn)輸和包裝上也有更多的優(yōu)點，符合農(nóng)藥劑型的發(fā)展趨勢[9-10]。本文以檸檬烯-6-醇新戊酸酯為研究對象，進(jìn)行了乳化實驗，測定了水乳劑對6種常見植物病原菌的抑制作用，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，將其開發(fā)成為農(nóng)藥新品種提供了理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL。

1.1.2 供試病原菌

辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小麥葉枯病菌(Alternaria triticina)、黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、梨黑斑病菌(Alternaria alternate)，以上植物病原菌均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)化保實驗室提供。

1.1.3 供試藥劑

Tween80、Span80，天津市北辰方正試劑廠；丙酮，天津市化學(xué)試劑六廠；2%多抗霉素(polyoxin)可濕性粉劑，山東省青島東生藥業(yè)有限公司；70%嘧霉胺(pyrimethanil)水分散粒劑，山東東泰農(nóng)化有限公司；檸檬烯-6-醇新戊酸酯，Sigma-Aldrich公司。

1.1.4 儀 器

DHT型攪拌恒溫加熱套，實驗室高剪切分散乳化均質(zhì)機(jī)(B25)。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)配乳化劑的研究

乳化劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)對配置成的乳化液的形成過程，以及理化性質(zhì)會有很大的影響[11]，本實驗所用的水乳劑是水包油型，先把乳化劑1 g和原藥5 g混合，然后攪拌狀態(tài)下加入2 g水配制成初乳，初乳用乳化均質(zhì)機(jī)低速攪拌加水至50 g，然后將高剪切分散乳化均質(zhì)機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)至10000 r/min乳化就得到實驗用的殺菌劑水乳劑。

1.2.2 藥劑實驗

抑菌實驗采用菌落直徑法[12]。用打孔器從菌種中截取菌碟，放到不同含藥處理后的PDA培養(yǎng)基中，當(dāng)實驗的供試病菌長出菌絲后，觀察記錄供試病菌的菌落生長直徑，抑菌實驗重復(fù)3次。

實驗過程中同時使用嘧霉胺和多抗霉素進(jìn)行對比實驗。在恒溫培養(yǎng)箱中保持25 ℃培養(yǎng)，當(dāng)對照的供試病菌的菌落直徑長到大于玻璃皿直徑的2/3時候，采用十字交叉法用直尺測量供試病菌在不同濃度含藥培養(yǎng)基上的菌落直徑，抑菌重復(fù)3次，求其平均值，計算每種藥劑處理后供試病菌的生長抑制率，對實驗數(shù)據(jù)分析采用回歸分析法，計算EC50、95%置信限值和毒力回歸方程式。

2 結(jié)果與討論

2.1 水乳劑配方

本實驗所需的水乳劑是水包油型，因此復(fù)配乳化劑的HLB取在8～18之間。不同配比的復(fù)配乳化劑對乳液穩(wěn)定性影響見表1。

表 1 不同比例的復(fù)配乳化劑對水乳劑穩(wěn)定性的影響

通過表1中的實驗發(fā)現(xiàn)，使用Tween80:Span80為10:8.6的比例配置水乳劑時，可以使復(fù)合的HLB值在10.05，這種復(fù)配后的水乳劑穩(wěn)定性最好，其他比例有分層現(xiàn)象出現(xiàn)。HLB值是使用表面活性劑的一個較重要的參考因素，可以通過不同的比例復(fù)配達(dá)到我們所需要的HLB值的實驗范圍，在預(yù)測的范圍內(nèi)通過實驗選取乳化最好，穩(wěn)定時間最長的比例組合。

2.2 抑菌活性測定

在實驗所設(shè)濃度條件下，10%水乳劑對6種病原菌菌絲生長影響的抑菌活性測定結(jié)果見表2。

表2 水乳劑對6種病原菌菌絲生長的影響

由表2可知，水乳劑對6種病原菌菌絲的生長均有一定的抑制作用，其EC50在40.33～73.02 mg/L之間，其中對黃瓜灰霉病原菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50為40.33 mg/L；其次為小麥赤霉病菌和辣椒枯萎病菌，其EC50分別為41.83和45.94 mg/L；黃瓜灰霉病原菌和小麥赤霉病菌都屬于半知菌亞門真菌，辣椒枯萎病菌屬于半知菌亞門的尖鐮孢菌辣椒專化型，這表明這種水乳劑對都屬于半知菌亞門真菌病原菌的三種病原菌抑菌活性存在一定差異。番茄早疫病菌、梨黑斑病菌和小麥葉枯病菌屬于鏈格孢屬病原菌，這種水乳劑對這3種鏈格孢屬病原菌菌絲生長的抑制作用較弱，EC50 在53.81～72.25 mg/L之間，雖然對六種植物病原菌的菌絲生長的抑制作用有強(qiáng)弱區(qū)別，但是這六種植物病原菌分屬于兩類，說明這種水乳劑不是單一對同一類型的植物病原菌有抑菌潛力。

2.3 水乳劑與2種殺菌劑的抑菌活性比較

2%多抗霉素可濕性粉劑和70%嘧霉胺水分散粒劑都可以用在室外黃瓜灰霉病的防治上，為了評價檸檬烯-6-醇新戊酸酯的10%水乳劑的應(yīng)用價值我們做了對比實驗。

表3 3種藥劑對灰霉病病原菌菌絲生長的影響

由表3可知，2%多抗霉素可濕性粉劑對黃瓜灰霉病原菌的EC50為533.45 mg/L；70%嘧霉胺水分散粒劑對黃瓜灰霉病原菌的EC50為142.42 mg/L。檸檬烯-6-醇新戊酸酯的10%水乳劑對黃瓜灰霉病原菌的EC50為40.33 mg/L，更低的EC50值表現(xiàn)出了較好的應(yīng)用潛力。水乳劑的室內(nèi)抑菌效果要明顯好于兩個對照的農(nóng)藥劑型，水乳劑的室外藥效對比實驗可以進(jìn)一步進(jìn)行研究，有進(jìn)一步的研究開發(fā)價值。

3 結(jié) 論

農(nóng)藥水乳劑是有機(jī)原藥被水乳劑分散后形成一個1 μm左右的乳化微粒于水中,形成的一種對生態(tài)環(huán)境友好型的農(nóng)藥制劑,目前農(nóng)藥新劑型正朝著水性、環(huán)保的方向發(fā)展，高效和安全的劑型是未來農(nóng)藥的發(fā)展方向。在當(dāng)前化學(xué)農(nóng)藥的各種劑型中，水乳劑是具有“綠色”特性的劑型之一，水乳劑的主要優(yōu)點是降低對人和環(huán)境的污染，本實驗正是使用水為溶劑，將殺菌活性物質(zhì)通過乳化劑的乳化作用，配制成水乳劑，當(dāng)Span80和Tween80兩種乳化劑質(zhì)量比為0.86時，檸檬烯-6-醇新戊酸酯的10%水乳劑的穩(wěn)定性最好。研究表明水乳劑對6種植物病原菌的菌絲的生長均有一定的抑制作用，對黃瓜灰霉病原菌的菌絲生長抑制作用最強(qiáng)，毒力回歸方程為Y=2.4172+1.6085x，抑制中濃度EC50為40.33 mg/L，要明顯好于對照的可濕性粉劑和水分散粒劑兩個農(nóng)藥劑型，有進(jìn)一步研究開發(fā)的價值。檸檬烯-6-醇新戊酸酯化合物的合成和田間藥效實驗還有待做進(jìn)一步的研究。