胸腺五肽的固相合成

2021-04-22 01:07:56唐文力李宜航

廣州化工 2021年7期

唐文力，李宜航

(常德職業技術學院，湖南常德 415000)

隨著醫藥產業的快速發展，多肽類藥物的發展正越來越引起醫藥界的關注。胸腺五肽在醫用上良好的產業前景使得人們將注意力紛紛集中在大規模生產上，由于采用生物提取會受材料來源限制，而基因表達技術運用在小分子肽上存在困難等問題，其分子式簡單的特點使化學法合成胸腺五肽獨具優勢，固相化學合成成為獲得胸腺五肽的重要途徑。

近年來，固相法得到了很大發展， Boc法[1](Boc:叔丁氧羰基)和 Fmoc固相法[2](Fmoc:9-芴甲氧羰基)。以這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發展，并仍在不斷得到改造和完善。本實驗采用Fmoc固相法，Fmoc法避免了接肽時反復使用強酸的弱點，每次去保護時釋放出可檢測的化合物以及沒有腐蝕性試劑參與反應，其溫和的反應條件使得反應過程溫和可控。此外，本研究采用的Rink樹脂合成片段還可以方便自動化生產[3-7]；Rink樹脂可以回收重復利用；適合大規模工業化生產，沒有劇烈的化學反應；降低了生產成本。

1 儀器與試劑

Waters 2695型高效液相色譜、Milli--Q超純水系統，德國默克密理博公司；紫外分光光度計、GL-150干式恒溫器(block heater)、XW-80A旋渦混合器，上海精科實業有限公司，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平TP-214，丹佛儀器有限公司(d=0.1 mg)；GL-150干式恒溫器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；R-100型旋轉蒸發儀，瑞士Buchi公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

Wang Resin(AR，南開和成科技有限公司，交聯度 1%，取代率 0.47 mmol/g)、二環己基碳二亞胺(DCC)、卡特縮合劑(BOP)、二甲氨基吡啶(DMAP)均采購自蘇州昊帆生物股份有限公司、甲醇、醋酸酐、吡啶、二氯甲烷均采購自天津市大茂化學試劑廠。

2 實驗方法

2.1 試劑配制

2.1.1 20%pip/DMF溶液(脫保護液)的配制

20%哌啶DMF溶液：取100 mL哌啶溶于400 mL DMF中。

2.1.2 磷酸緩沖液的配制

將2.738 g NaH2PH4·2H2O(M=156.01)和9.834 g Na2HPH4·12H2O(M=358.14)溶于900 mL純水中，溶解后，再加入100 mL甲醇，混勻。制成磷酸緩沖液。

2.1.3 裂解液的配制

TFA(三氟乙酸):TIS(三異丙基硅烷):H2O (純水)=95:2.5:2.5 (體積比)，制成裂解液。

2.1.4 茚三酮反應所需溶液的配制

(1)溶液a的配制

溶液1：取4 g苯酚溶于1 mL無水乙醇(80%苯酚/無水乙醇溶液[w/v])，加熱至溶解。

溶液2：取0.2 mL KCN(0.001 mol)溶于9.8 mL吡啶中。

溶液a：混合溶液1，溶液2。

(2)溶液b的配制

稱500 mg茚三酮溶于10 mL無水乙醇中(5%茚三酮/無水乙醇溶液，[w/v])，密閉避光保存。

檢驗時加2滴溶液a，1滴溶液b。

2.2 標準曲線的繪制

以Fmoc-Ala-OH為標準物質,準確稱量Fmoc-Ala-OH(帶Fmoc的丙氨酸)39.5 mg，用1 mL 20%pip/DMF處理20 min，取其中0.1 mL 用DMF稀釋到10 mL配置成濃度依次為21 μmol/L、42 μmol/L、68 μmol/L、85 μmol/L、106 μmol/L、177 μmol/L的混合溶液，放置待用，見表1。

表1 不同濃度的Fmoc-Ala-OH溶液及吸光度

制成標準曲線見圖1。

圖1 丙氨酸標準溶液曲線

2.3 胸腺五肽合成

2.3.1 Fmoc-Tyr(tbu)-Val-Asp(tBu)-Lys(BOC)-Arg-樹脂的合成

稱取樹脂0.5 g 于10 mL 反應器中，依次稱量Fmoc-Tyr(tbu)-OH 0.25 mmol，230 mg，DCC 0.25 mmol，103 mg，DMAP 0.025 mmol，3 mg。溶于2.5 mL DMF。倒入反應器中，溶脹30 min后，加2 mL DMF 搖晃3 h，接著樹脂用DMF洗四遍，甲醇洗四遍，抽極其干。取2 mg樹脂于 1.5 mL離心管中，加1 mL 20%pip/DMF溶液處理20 min，稀釋10倍，測吸光度將5 mL此稀釋液加入50 μL原液(取自1 mL 20%pip/DMF溶液)，測吸光度，并根據標準曲線計算取代率。

取1.25 mmol 醋酐(118 μL)，1.25 mmol 吡啶(100 μL)，7 mL DMF一并倒入反應器，反應30 min。抽去反應液，并用DMF洗滌2次、IPA洗滌3次、DMF洗滌4次。洗滌完成后，取少許樹脂，滴入2.1.4配制的茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍黑色。

稱Fmoc-Val-OH 0.5 mmol，170 mg。BOP 0.5 mmol，221 mg，3 mL DMF中斡旋溶解，加DIEA0.5 mmol，88 μL。斡旋混勻。于室溫下放置10 min后倒入反應器，反應2 h。反應完成后，用DMF洗滌4遍，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入2.1.4配制的茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈無色，既反應完全。

得到Fmoc-Tyr(tBu)-Val-樹脂后，量取約7 mL脫帽試劑20%pip/DMF溶液，倒入反應器中，反應20 min，抽去反應液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入2.1.4配制的茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍黑色，既獲得Tyr(tBu)-Val -樹脂。在獲得Tyr(tBu)-Val-樹脂后，按照上述縮合反應方法，依次Tyr(tBu)-Val-樹脂上連接氨基酸保護單體：Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Arg-OH后得到Fmoc-Tyr(tbu)-Val-Asp(tBu)-Lys(BOC)-Arg-樹脂。

2.3.2 胸腺五肽粗品制備

取2.3.1步驟制備的Fmoc-Tyr(tBu)-Val-Asp(tBu)-Lys(BOC)-Arg-樹脂置于干凈的10 mL玻璃反應器中，用配制的高酸裂解液裂解樹脂。每次加入約2 mL裂解液，每次裂解時間為20 min，共裂解三次。將每次裂解后的濾液收集在同一100 mL的離心管中。

在濾液加入約10 mL 60%的乙醚溶液，震蕩混勻。該溶液在4 ℃下，9000 r/min高速離心5 min。離心后倒出上清液(棄)，再加入約10 mL 60%的乙醚溶液，洗滌析出固體，再重復離心。共離心三次。最后一次倒出上清液后，將離心管置于通風櫥中風干。收集風干后的五肽樣品，置于1.5 mL離心管中備用。

3 結果表征

3.1 樹脂取代率的測定

根據丙氨酸標準溶液C-Abs曲線，將A301 nm(y)=0.375帶入y=0.0075x+0.0237，可以計算氨基的濃度(x)為8.97 μmol/L。

取干燥樹脂2 mg測吸光度，考慮到稀釋了100倍，則

取代率=8.97 μmol/L× 100/1000/2 mg=0.449 mmol/L

3.2 樹脂回收率的計算

脫保護后的樹脂，稱重，質量為m1=8 mg，離心，置于通風櫥中風干后，稱重，質量為m2=2.3 mg，則：

理論質量m3=8 mg×0.47 mmol/g×680=2.556 mg

樹脂回收率=2.3 mg/2.556 mg=89.98%

3.3 高效液相色譜級質譜分析

對胸腺五肽粗品及標準品進行HPLC分析，色譜柱為Krosmail100-5 C18柱(250 mm×9.4 mm，5 μm)；流動相A相(0.1M NaH2PO4/H2O)，洗脫液B(MeCN-H2O=1:1)；梯度洗脫：0～30 min；70%B～40%A，流速為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm，其純度為98.54%，見圖2～圖4。