腦轉移及動物模型制備的研究進展

趙 峰，楊林杰,2，周曉坤，呂 良*

（1.桂林醫學院藥學院藥理教研室，廣西 桂林 541199；2.廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，廣西 南寧 530021；3.桂林醫學院附屬醫院神經外科，廣西 桂林 541001）

惡性腫瘤腦轉移（brain metastases）被認為是腫瘤進展過程中的晚期事件，對患者的生存質量和生存進程有著破壞性的影響。所有部位惡性腫瘤發生腦部（包括腦實質與腦膜）轉移的總發病率約為10%，常見發生腦轉移的惡性腫瘤包括：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤及腎癌[1]。研究表明[2]，隨著分子靶向藥物的治療，肝癌等的腫瘤患者生存時間得到延長，腦轉移的發病率也呈上升的趨勢。腦轉移的治療是棘手的，目前的治療方式以手術、全腦放療、立體定向放射治療及化療為主，但均是姑息性的，預后仍然很差[3]。建立理想的腦轉移動物模型對于腦轉移發生發展機制的探究與治療藥物的研發具有重要的意義，本文概述腦轉移發生的機制，并就腦轉移動物模型的制備方式、應用及進展作一綜述。

1.腦轉移機制概述

經典的“種子與土壤”假說認為，作為“種子”的腫瘤細胞，只有那些增殖能力強、更具遷移力和侵襲力的腫瘤細胞可以成功實現腦部的轉移。有研究[4]將相匹配的原發灶與轉移灶內腫瘤細胞進行基因檢測比較，證實盡管轉移灶與原發灶的腫瘤同源，但是存在有部分基因擴增或缺失、過度表達或激活、表達不足或失活，說明腫瘤細胞在轉移部位發生了獨特的改變。這些轉移灶內發生的與其原發部位不同的基因型改變的包括有CDKN2A和PIK3CA的不同突變、PTEN的丟失、ERBB2的擴增等，這些基因改變涉及細胞增殖、生長和生存的調控。作為“土壤”的腦部定植部位，通過細胞信號傳導途徑，使局部微環境發生改變，如引發炎癥反應、增加血管內皮通透性、破壞血腦屏障功能、促血管生成等。

血行轉移是其主要轉移途徑，如圖1所示，一般會經歷：腫瘤細胞從原發灶分離、侵入血管、通過血液循環運輸、到達腦部并滲出血管、腦組織內定植生長。

圖1 惡性腫瘤腦轉移一般過程簡圖

轉移級聯過程涉及復雜及串擾的分子機制。首先，腫瘤細胞通過主要由轉化生長因子-β通路（TGF-β）參與調控的上皮細胞-間充質轉化（EMT）獲得間質細胞所具有的遷移和侵襲能力從原發部位脫離[5]，繼而富集在血管周邊的巨噬細胞分泌細胞因子，這些因子以血管為中心擴散，從而形成了一個指向血管的濃度梯度，從原發灶脫落的腫瘤細胞可以沿著這一濃度梯度向血管作趨化運動[6]。在這一過程中，血管附近巨噬細胞分泌的EGF，腫瘤細胞分泌的CSF-1等趨化因子發揮了重要作用。在血液循環系統中，血小板為腫瘤細胞的存活提供了保護，它會粘附于腫瘤細胞表面形成血小板-腫瘤細胞聚合體，使腫瘤細胞逃避免疫識別[7]。腫瘤細胞到達腦部，被毛細血管截留（循環停止），被認為是其主要的捕獲機制[8]。

腦部具有其獨特的解剖、代謝、免疫微環境，神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞等是其主要細胞成分，血腦屏障（BBB）、血腦脊液屏障（BCSFB）是中樞神經系統的守門人，通過封閉腦毛細血管內皮細胞或特殊的上皮和軟腦膜細胞的緊密連接的作用，保護大腦免受大規模炎癥的潛在致命后果[9-10]。既往大腦被認為是免疫特權器官的場所，事實上，現在已經證實肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和腎癌患者腦轉移中存在腫瘤浸潤性T淋巴細胞[11]。此外，組織蛋白酶S被發現在乳腺癌患者的腦轉移中表達顯示其介導乳腺癌細胞通過BBB的遷移[12]。星形膠質細胞在腦轉移的過程中起到了重要的作用，研究表明其可以通過激活腦轉移癌細胞中的PPARγ[13]、促進縫隙連接轉運cGAMP從而激活癌細胞的STAT1和NF-κB通路[14]、調節CXCL10-CXCR3軸[15]等促進腦轉移的發展。腦部微環境是決定腦轉移發展的中心因素，因此，剖析腫瘤細胞跨BBB、阻斷腦自然防御及與其他細胞間的相互作用有助更好地理解解腦轉移生物學的關鍵信息。

2.腦轉移模型制備策略

研究腦轉移的“最佳”模型應該取決于所要聚焦的方向。在腫瘤的異質性或人類特有的基因變化的研究中，因具有重現人類遺傳和表觀遺傳改變以及腫瘤內異質性的優勢，以裸鼠為代表的異種移植模型往往是最佳選擇，但代價是犧牲宿主中完整的免疫系統[16]。免疫活性人源化受體小鼠用于建立人類來源的異種移植物的最新進展也許是一個具有前景的選擇[17]。因此，如果聚焦于癌細胞和免疫細胞的相互作用，那么同基因或免疫活性動物是理想的。如果聚焦于原發腫瘤向轉移腫瘤的進展上，那么基因工程小鼠模型（GEMM）是理想的。此外，使用熒光標記細胞并利用生物發光成像進行追蹤[18]、以三維微流控系統模擬血腦屏障的關鍵結構[19]、器官型腦片培養[20]等重要的研究技術目前已成為腦轉移研究手段中不可或缺的組合策略。

3.腦轉移腫瘤接種方式

理想的腦轉移模型可完全概括轉移級聯，擁有完整的免疫系統，因此原發腫瘤的自發腦轉移模型具有很高價值。現實科研實踐中，綜合研究目的、效率與準確的平衡、藥物篩選等的客觀需求，如圖2所示，目前主流的實驗方法是將親腦細胞系通過注射移植以誘導腦部轉移。

圖2 腦轉移造模接種方式示意圖

3.1 腦立體定位注射

Soto等[21]詳細介紹了借助于腦立體定位儀進行腫瘤細胞直接腦內植入造模的方法，這種模型涵蓋了轉移過程的播種和定植階段，可用于分析中樞神經系統特定區域內的腫瘤增殖和腫瘤-宿主細胞相互作用。Wang等[22]將保留有部分腫瘤基質的人源腦轉移組織直接植入裸大鼠腦內，采用MRI、免疫組化、DNA拷貝分析等將異種移植物與患者的腫瘤進行比較。模型腦轉移表現出與臨床觀察相似的放射學特征，原發腫瘤、患者腦轉移瘤和異種移植瘤在組織學和生長模式上有顯著的相似性，DNA拷貝數分析顯示染色體含量的增加和減少有很強的相似性，因此這種腦轉移模型可作為評估治療反應和研究腫瘤中樞神經系統轉移背后機制的一個重要工具。

3.2 尾靜脈注射

張峻青等[23]使用人肺癌細胞株PC-14反復通過尾靜脈注射接種裸鼠以篩選出特異性腦轉移肺癌細胞株。一次接種約25%的裸鼠產生腦轉移，經4個循環反復接種篩選得到具有腦轉移特異性的PC-14/B細胞株，篩選獲得的亞株經尾靜脈注射可產生4/5的腦轉移。杜琴等[24]將肺癌細胞A549與卵巢癌細胞Skov3分別通過尾靜脈、腹腔、頸動脈及顱內途徑接種（每組16只裸鼠），結果顯示尾靜脈注射、腹腔注射和頸動脈注射途徑Skov3細胞組未發現腦內成瘤，A549細胞組前兩種方式各發生2例，后者發生8例顱內成瘤，認為血腦屏障可能在阻止卵巢癌腦轉移過程中起了重要作用。因此，尾靜脈注射方式在篩選高特異性腦轉移腫瘤細胞株、研究某些腫瘤相對較少發生腦轉移的機制中有其特殊的意義。

3.3 左心室注射

Conley[25]詳細介紹了左心室注射的操作技術：麻醉后仰臥位固定小鼠，前胸壁消毒后在上胸廓做中線切口，露出鎖骨和上肋骨，確定第二肋間隙，將注射針插入約4mm，從胸骨左側2mm開始與胸壁呈45°角將針頭插入左心室，緩慢注射總體積約200μl（1×105個細胞）的腫瘤細胞懸液，注射完畢退針封閉切口。

陳愉生等[26]對比經胸腔原位種植與經左心室注射建立肺癌腦轉移動物模型，結果顯示使用人肺腺癌PC-9細胞通過兩種方式造模，前者腦轉移率為11.1%，后者腦轉移率為100%，說明左心室注射法保證了更高的腦轉移率。

Bos等[27]使用ER-的人源乳腺癌細胞CN34與具有肺、骨轉移傾向的ER-的乳腺癌細胞MDA-MB-231通過左心室注射方法接種于免疫缺陷雌性小鼠，篩選出具有腦轉移特異性的亞克隆，對其進行基因表達及功能分析，確定了環氧合酶COX2、表皮生長因子配體HBEGF、α2，6-唾液酸轉移酶ST6GALNAC5是作為癌細胞通過血腦屏障的關鍵介質。

左心室注射方式大多數小鼠耐受手術且顯著降低個體動物的總腫瘤負擔，接種的細胞避免了肺毛細血管床的阻滯直接進入體循環，通過動脈系統向腦部轉移，到達腦部后進行粘附、增殖、遷移等一系列生物學行為，提高了腫瘤細胞的轉移率亦很好的部分模擬了血行播散過程。

3.4 頸動脈注射

Zhang等[28]介紹了頸動脈注射的具體操作步驟：仰臥位固定小鼠，吸入麻醉后頸部消毒，行頸部正中切口約1cm，向下鈍性分離暴露頸總動脈，在頸總動脈近心端結扎阻斷血流，遠心端打松結備用，使用31G針頭注射器在解剖顯微鏡下在兩結之間進針并緩慢注射腫瘤細胞懸液（總體積100μl，含1-5×105個細胞），注射完畢后系緊遠心端結并關閉切口。

徐磊等[29]使用GFP標記的Lewis肺癌細胞3LL經頸動脈注射方式建立C57BL/6X小鼠腦轉移模型，造模動物手術存活率93.75%，手術成功的小鼠術后發生腦轉移率100%。魏水劍等[30]使用非小細胞肺癌PC-9細胞通過頸內動脈注射方式建立裸鼠腦轉移模型并用MRI成像儀經行活體檢測，建模成功率為71%，證明該注射技術是一種經濟高效的腦轉移造模方式。此外，頸動脈注射還可以將藥物、病毒顆粒等其他外源性物質向中樞神經系統高效輸送，用作評價藥物治療效果、研究病原體感染腦部病理機制的手段[31]。

4.結語

腦部微環境作為目前研究的熱點，其獨特的細胞類型、解剖結構、代謝特點、免疫環境與顱外病變微環境截然不同，對腫瘤細胞所施加的選擇性壓力密切影響腫瘤的轉移過程和治療反應，這凸顯了開發包含完整的轉移級聯和/或腦部微環境的實驗模型的重要性。本文概述了腦轉移的相關機制及主要的動物模型制備方法，其中立體定向注射可以實現腫瘤細胞在腦實質內生長的檢測，心內注射和頸動脈注射可以模擬癌細胞向血液中的擴散，并可用于研究通過血腦屏障的外滲以及在腦內的定植和生長。現有的臨床前模型各有側重的部分揭示了腦轉移這一復雜的轉移級聯過程，未來對腦部具有趨向性的細胞系的擴充建立、造模方式的優化、活體檢測技術的完善以及生物信息學的進展將有助于人們更好的認識腦轉移生物學的關鍵信息從而更有效地針對關鍵靶點進行干預治療。