機械損傷及埋土深度對杉木萌蘗及抗氧化酶活性的影響

張吉玲，陳 鋼，曹光球，林思祖,，鄭 宏，李 勇

（1. 福建農林大學 林學院，福建 福州 350002；2. 福建農林大學 國家林業草原杉木工程技術研究中心，福建福州 350002；3. 福建省洋口國有林場，福建 順昌 353200）

杉木Cunninghamia lanceolata是中國南方最重要速生樹種之一，具有較強的萌芽能力[1-2]。隨著現代林業的發展，無性林業成為當今社會林業發展的一個主要方向。隨著近十幾年來的杉木苗木繁育技術的研究，杉木無性繁殖取得了較大的突破，無性系造林面積越來越大。組培和扦插是杉木無性繁育的2個主要途徑。由于杉木組培工廠化育苗過程中還普遍存在增殖系數低、生根率低等問題，扦插繁殖是杉木無性繁育的最主要途徑。杉木采穗圃是提供穗條的最主要場所，為促進杉木的萌蘗能力，提高穗條的產量，去頂、壓彎及基部損傷處理是常用的幾種措施。目前，對母樹的彎干、截干、淺栽、施肥等方面進行了研究[3-4]。機械損傷后，植物產生一系列次生代謝產物，如酚類、黃酮類、萜類、生物堿等，它們集中在傷口及其附近，參與傷口愈合反應，抵抗昆蟲或病原體的入侵[5]。抗氧化酶在催化這一途徑中起著非常重要的作用，對植物生長發育、紫外線輻射防治、抗蟲害和植物支持系統的形成具有重要的意義和價值，其活性可作為衡量植物抗逆性強弱的指標[6]。酚類物質在植物抗生物脅迫機制中起著重要作用。機械損傷也被認為是誘導植物防御的重要手段之一[7]。雖然近年來對機械損傷影響植物防御酶的影響研究較多，但是關于機械損傷和不同埋土深度處理對杉木無性系萌蘗抗氧化酶活性的機制研究卻鮮少報道。本研究以萌蘗能力較強的杉木無性系洋020扦插苗為研究對象，通過室內盆栽試驗，分析機械損傷和不同埋土深度對無性系萌蘗能力及不同器官抗氧化酶活性的影響，為揭示杉木萌蘗機制以及杉木人工林的高效培育奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為福建省洋口國有林場提供的1年生杉木洋020扦插苗。挑選生長健壯、長勢一致、無病蟲害的苗木，平均苗高30 cm，地徑為5 mm。盆栽土壤為山地黃心土，有機質49.00 g·kg-1，全氮1.09 g·kg-1，水解氮 1.32 mg·kg-1，速效磷 2.30 mg·kg-1，速效鉀 151.30 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗在福建農林大學國家林業草原杉木工程技術研究中心田間實驗室內進行。2019年3月中旬將杉木無性系洋020扦插苗種植于花盆(21 cm×26 cm×27 cm)中，3株·盆-1。培養基為黃心土。采用隨機區組試驗，6個處理，處理1為去頂埋土深度0 cm (TP1)，處理2為去頂埋土深度3 cm (TP2)，處理3為去頂埋土深度6 cm (TP3)，處理4為未去頂埋土深度0 cm (ck1)，處理5為未去頂埋土深度3 cm (ck2)，處理6為未去頂埋土深度6 cm (ck3)；去頂處理為苗木培養7 d后剪去頂稍1 cm；每個處理40盆，共240盆。盆栽后定期調查不同處理杉木基部的萌芽數。培養期間定期給苗木澆自來水，保持土壤含水率在65%左右；定期除草。2019年6月30日(萌蘗初期)、7月31日(萌蘗中期)、8月31日(萌蘗后期)取已萌芽的洋020扦插苗的枝葉、基部皮及根尖樣品，每個處理采集9株，每3株混成1個待測樣，每個部位待測樣3個重復。不同部位樣品取樣后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。

1.3 測定方法

1.3.1 萌蘗數調查 2019 年4月30日、5月31日、6月30日、7月31日、8月31日分別調查不同處理幼苗的萌蘗數。

1.3.2 抗氧化酶活性測定 參照李合生的方法[8]取葉片、基部皮及根尖0.2 g，加入0.05 mol·L-1pH 7.8磷酸緩沖液228.75 mL，母液B(NaH2PO4)21.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL。在冰浴中用研缽研磨成勻漿，稀釋至4 mL刻度離心管，在4 ℃下以10 000 r·min-1的速度冷凍離心20 min，并將上清液置于4 ℃冰箱中冷藏。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照丁紅等[9]方法，以抑制氮藍四唑(NBT)光還原的50%為1個酶活性單位。過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性參照SHALATA等[10]的方法測定。

1.4 數據處理

數據用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行整理和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 機械損傷和埋土深度對杉木無性系萌蘗的影響

表1結果顯示：隨著培養時間的延長，杉木萌蘗均呈上升趨勢，隨著埋土深度的增加，杉木萌蘗能力呈逐漸下降的趨勢，在相同埋土深度條件下，去頂處理比未去頂處理杉木萌蘗能力更強。萌蘗后期(8月)，埋土深度0、3、6 cm去頂處理苗的萌蘗數與同一埋土深度未去頂處理相比分別提高15.11%、6.73%及3.49%；去頂處理苗埋土深度6 cm處理的萌蘗數分別比埋土深度3及0 cm處理降低5.67%及34.29%，未去頂處理苗埋土深度6 cm處理的萌蘗數分別比埋土深度3及0 cm處理降低4.21%及25.87%。

表1 機械損傷和不同埋土深度處理下杉木無性系萌蘗差異Table 1 Difference of tillering of Chinese fir clones treated by mechanical damage and different soil depth

2.2 機械損傷和埋土深度對杉木無性系不同部位抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD活性 由圖1看出：在萌蘗后期，杉木幼苗基部皮SOD活性除TP2較低外，其余處理均顯著高于前期和中期。ck1、ck2、ck3、TP1、TP3的杉木幼苗枝葉萌蘗后期SOD活性相比于前期分別提高36.08%、45.76%、63.65%、31.56%、57.27%，相比于中期分別提高了41.99%、25.77%、49.59%、49.00%、21.23%。杉木幼苗枝葉SOD活性普遍以TP1較低，在萌蘗前期、中期和后期分別為300.99、343.08、354.89×16.67 nkat·g-1。在后期，ck3、ck2和TP3的杉木幼苗枝葉SOD活性相比于前期和中期顯著上升，其中相比于前期分別提升了40.57%、54.06%和76.00%，相比于中期分別提升了18.28%、46.95%和45.86%。而杉木幼苗不同機械損傷和不同埋土深度間處理下的杉木幼苗根尖SOD活性則不具有明顯規律。

圖1 機械損傷和不同埋土深度處理下杉木幼苗SOD活性Figure 1 SOD activity of Chinese fir seedlings under mechanical damage and different soil depth treatments

2.2.2 CAT活性 由圖2可以看出：在萌蘗前期，杉木幼苗枝葉、基部皮和根尖CAT活性，從高到低排序均為TP3、TP2、TP1，ck1、ck2和ck3。TP3處理杉木枝葉CAT活性相比于TP2、TP1、ck3、ck2和ck1分別高出了459.29%、1 004.03%、366.34%、81.98%和20.30%，基部皮分別高出了419.75%、241.20%、204.15%、86.01%和43.44%；根尖分別高出了1 123.06%、933.10%、125.46%、63.93%和23.83%。在中期和后期，杉木幼苗枝葉、基部皮和根尖CAT活性均迅速下降，在中期，TP3、TP2、TP1、ck3、ck2和ck1的杉木葉片CAT活性相比于前期分別下降了36.35%、41.02%、57.08%、85.01%、89.90%和90.82%，杉木基部皮CAT活性相比于前期分別下降了20.56%、66.32%、84.29%、94.55%、85.56%和95.33%，杉木根尖CAT活性相比于前期分別下降了-47.49%、-18.77%、88.11%、92.36%、87.91%、4.52%。杉木幼苗枝葉CAT活性在中期ck2和ck1較高，在后期TP2、TP1、ck2和ck1較高。在中期和后期，杉木幼苗基部皮和根尖CAT活性規律較為統一，且總體處于較低水平。基部皮CAT活性在中、后期從高到低排序為ck2、TP3、ck3、ck1、TP1、TP2，根尖CAT活性在中、后期從高到低排序為ck2、ck3、TP3、TP2、ck1、TP1。

圖2 機械損傷和不同埋土深度處理下杉木幼苗CAT活性Figure 2 CAT activity of Chinese fir seedlings under mechanical damage and different soil depth treatments

2.2.3 POD活性的影響 由圖3可以看出：在萌蘗前期，未去頂的杉木枝葉、基部皮和根尖POD活性高于中期和后期。杉木枝葉POD活性前期ck1、ck2和ck3比中期分別提高了109.85%、61.63%和102.35%，比后期分別提高了135.99%、62.85%和115.02%；杉木基部皮POD活性前期ck1、ck2和ck3比中期分別提高了147.98%、141.16%和187.70%，比后期分別提高了59.14%、22.82%和61.56%；杉木根尖POD活性前期ck1、ck2和ck3比中期分別提高了174.74%、107.14%和134.69%，比后期分別提高了143.91%、45.47%和85.89%。在萌蘗前期，未去頂的杉木苗枝葉、基部皮和根尖POD活性普遍較高，POD活性從高到低依次為ck1、ck3、ck2。在中期，杉木幼苗基部皮和根尖POD活性以TP2、TP3較高。

圖3 機械損傷和不同埋土深度處理下杉木幼苗POD活性Figure 3 POD activity of young Chinese fir treated with mechanical damage and different soil depth

2.2.4 多因素方差分析 由多因素方差分析(表2)可知：不同時期、不同機械損傷和不同部位之間SOD和POD活性具有極顯著差異(P＜0.01)，且3種因素之間具有極顯著的交互作用(P＜0.01)。不同時間、不同機械損傷、不同埋土深度和不同部位之間CAT活性具有極顯著差異(P＜0.01)，4種因素之間具有極顯著的交互作用(P＜0.01)。

表2 杉木幼苗 SOD、CAT 和 POD 活性方差分析Table 2 Variance analysis of SOD, CAT and POD enzyme activities in Chinese fir seedlings

2.3 機械損傷和不同埋土深度處理杉木無性系不同器官抗氧化酶活性相關性

由表3可見：萌蘗數與機械損傷呈極顯著負相關(P＜0.01)；萌蘗數與萌蘗時期呈極顯著正相關(P＜0.01)，SOD活性與萌蘗時期呈極顯著正相關(P＜0.01)；SOD活性與萌蘗數呈顯著正相關(P＜0.05)，CAT活性與機械損傷呈極顯著正相關(P＜0.01)；CAT活性與萌蘗時期、萌蘗數和SOD活性呈極顯著負相關(P＜0.01)，POD活性與萌蘗時期、萌蘗數呈顯著正相關(P＜0.05)；POD活性與SOD活性呈極顯著正相關(P＜0.01)，POD與CAT活性呈顯著負相關(P＜0.05)。

表3 機械損傷和不同埋土深度處理杉木無性系萌蘗酶活性相關性Table 3 Correlation between mechanical damage and tillering enzyme activity of Chinese fir clones under different soil depth treatments

3 討論

本研究表明：隨著培養時間的延長，杉木萌蘗均呈上升趨勢；隨著埋土深度的增加，杉木萌蘗能力逐漸呈下降的趨勢。在萌蘗后期，TP1、TP2和TP3的萌蘗數與同一埋土深度ck1、ck2和ck3相比分別提高15.11%、6.73%及3.49%。說明適度的機械損傷對杉木萌蘗影響較大，利于無性系的繁殖。植物通過自然選擇和人工選擇，逐漸形成相應的防御機制，有助于損傷部位的愈合，并誘發全株反應，防止進一步損傷的發生。可以根據植物對機械損傷的特殊反應強化植物的抗蟲抗病能力，減少施藥對人類健康以及生態環境的損害，也可以探索防御反應的發生機制，以期遏制植株的“過度反應”，減少生產上的經濟損失[11-12]。

生物轉化是利用細胞、器官或酶等生物體系進行催化的反應。由于生物轉化的多樣性涉及到許多酶，SOD活性過高，會影響某些正常的氧化代謝過程[13]。由于SOD具有親核性和還原性，一定微環境下，具有很強的氧化損傷作用[14]。低CAT活性的植株對過氧化氫(H2O2)脅迫更加敏感，CAT作為植物體內重要活性氧清除酶，可與質膜透性一起表征植物受逆境傷害的程度，兩者在脅迫發生后一段時間內的變化態勢，可反映植物自身修復過程中的一些信息[15-16]。POD在回收過程中具有雙重功能。一方面，POD可以在逆境或衰老的早期表達以去除H2O2，是活性氧保護酶系統的成員之一；另一方面，POD也可以在逆境或衰老的后期表達以參與活性氧的產生和葉綠素的降解，引起膜脂過氧化，這是植物衰老的產物，可以作為衰老的指標。本研究表明：去頂后埋土3 cm和去頂后埋土6 cm處理下的杉木幼苗葉片SOD活性相比于萌蘗前期和后期明顯上升，不同部位中CAT活性總體呈下降趨勢，葉、基部皮和根尖中POD活性呈增長趨勢。李惠梅等[17]研究了增強UV-B輻射對麻花龍膽Gentiana straminea抗氧化酶系統的影響。結果表明：UV-B處理后，麻花龍膽葉片中SOD和POD活性在處理初期升高，但隨著處理時間的延長，SOD和POD活性降低，CAT活性顯著降低。這與本研究結果有一致和不同之處。生物代謝中酶活性的變化反映了環境物理化學變化，可以為環境變化提供早期預測。因此，越來越多的學者關注逆境下植物體內酶的變化，試圖利用酶的變化來判斷植物對環境的響應[18]。不同植物對逆境的應激方式不盡相同，適應逆境的機制十分復雜。

4 結論

隨著埋土深度的增加，不同埋土深度杉木無性系苗萌蘗能力均呈降低的趨勢，同一埋土深度下機械損傷處理無性系苗萌蘗力高于未機械損傷。隨著埋土深度的增加，杉木幼苗枝葉SOD活性呈上升趨勢，CAT活性呈下降趨勢；埋土6 cm處理有利于枝葉及根尖POD的積累；杉木幼苗不同器官植物抗氧化酶活性的差異應與杉木對機械損傷和埋土深度處理的生理應答機制有關。本研究結果在一定程度上反映機械損傷和不同埋土深度處理后杉木無性系萌蘗SOD、CAT和POD活性的變化規律，但在杉木萌蘗過程中抗氧化酶活性之間如何維持平衡，以及如何協同作用調控杉木萌蘗等的機制尚不清楚，這有待于今后進一步深入研究。