全自動在線HS-SPME-GC-MS/MS檢測魚塘投毒案件水樣中的13種有機磷農藥

王 丹,宋 歌,姜 紅,董林沛,趙 鵬

(1. 中國人民公安大學偵查學院，北京 100038; 2. 公安部物證鑒定中心，北京 100038)

0 引 言

有機磷農藥是含有磷酰（P=O）或硫代磷酰基（P=S）的磷酸或膦酸衍生物，因為具有高效廣譜、環境半衰期短、價格低廉等優勢，是當今世界農藥中最主要的類別之一，也是國內生產和使用最廣泛的農藥類別。有機磷農藥會抑制乙酰膽堿酯酶的活性，對所有以膽堿酯酶為神經傳導介質的生物都具有殺傷作用[1-3]。低濃度的有機磷農藥會使魚類等水生動物慢性中毒，影響其生長和繁殖，高濃度的有機磷農藥則會直接導致其死亡[4]。因為容易獲得，有機磷農藥常被不法分子用于魚塘投毒案件中，導致養殖魚大量死亡，影響生產和經濟秩序。快速準確地對魚塘投毒案件水樣中的有機磷農藥進行檢測，能夠為案件偵破及法庭訴訟提供證據。

目前檢測水樣中有機磷農藥主要采用氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、氣相色譜-質譜聯用法[7-9]以及液相色譜-質譜聯用法[10-11]等。氣相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法在進樣前需要使用液-液萃取[12]、固相萃取[13]等前處理方法對1 L水樣中的有機磷農藥進行提取富集，操作過程復雜，耗費時間長。液相色譜法和液相色譜-質譜聯用法通常采用直接進樣方式[14]或者經固相萃取[15]后進樣，但是液相色譜法和液相色譜-質譜聯用法對于有機磷的檢出限較高。以上方法存在靈敏度低、用料多、操作復雜費時等問題，無法滿足公安機關對魚塘投毒案件水樣中有機磷農藥的檢測需求。實驗建立全自動在線頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-串聯質譜技術（GC-MS/MS）檢測魚塘投毒案件水樣中13種有機磷農藥的方法，具有操作簡單、用料少、靈敏度高等優點，能夠滿足公安機關對于魚塘投毒案件水樣中有機磷農藥的檢測需求。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

氣相色譜-三重四級桿串聯質譜儀：GCMSTQ8050 NX，日本Shimadzu公司；DB-5ms色譜柱：30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Agilent公司；PAL RSI全自動樣品處理及進樣系統（帶頂空萃取模塊）：瑞士CTC Analytics公司；Milli-Q Direct水純化系統：德國Merck Millipore公司；100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取纖維頭：瑞士CTC Analytics公司。

1.2 試劑

敵敵畏、滅線磷、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、二嗪磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷、殺撲磷標準樣品（德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度≥98%）；甲醇（美國Fisher Scientific公司，色譜純）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）。

1.3 標準溶液配制

使用甲醇將敵敵畏、滅線磷、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、二嗪磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷、殺撲磷標準品配置成質量濃度為1 mg/mL的單標準儲備溶液，于-20 ℃保存。分別移取1.0 mL 上述單標準儲備溶液于50.0 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成10 μg/mL的混合標準儲備溶液，于-20 ℃保存。

標準工作溶液使用一級水逐級稀釋成所需的質量濃度。

1.4 實驗方法

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5 ms毛細色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（99.999%），恒流模式，流量1.56 mL/min；進樣口溫度：260 ℃；不分流進樣模式；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升至 280 ℃，保持 5 min。

1.4.2 質譜條件

電子轟擊離子源（EI源），離子源溫度200 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲時間2 min，掃描方式為多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM），掃描間隔0.1 s，碰撞氣為高純氬氣（99.999%）。

1.4.3 頂空固相微萃取條件

取2.0 mL水樣于20 mL頂空瓶中，加入0.6 g NaCl，旋緊裝有聚四氟乙烯/聚硅氧烷蓋墊（PTFE/Silicone）的螺紋蓋，放入樣品盤中。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，設置PAL RSI全自動樣品處理及進樣系統參數，見表1。

表1 SPME參數設置

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

采用Q3Scan掃描方法分析10 μg/mL 13種有機磷農藥的混合標準溶液，選擇豐度高且質荷比大于100的特征離子作為母離子，分別篩選出13種目標物的母離子，設置碰撞能（CE）范圍為3～45 eV，使用產物離子掃描方法進一步得到各目標物最佳CE電壓以及離子豐度比值，建立MRM分析方法。13種有機磷農藥的總離子流色譜圖見圖1，優化后的質譜參數見表2。

圖1 13種有機磷農藥的總離子流色譜圖

表2 目標物的保留時間和質譜參數

2.2 萃取條件優化

根據MRM掃描方式下各待測物的儀器響應值，使用一級水稀釋配制質量濃度分別為1 ng/mL的治螟磷、甲拌磷、毒死蜱、倍硫磷、特丁硫磷、地蟲硫磷，10 ng/mL滅線磷、二嗪磷、對硫磷，50 ng/mL甲基對硫磷、敵敵畏、馬拉硫磷、殺撲磷的混合工作溶液。在上述儀器條件下分別優化萃取溫度、萃取時間、樣品體積以及溶液的離子強度。

2.2.1 萃取溫度優化

取1 mL工作溶液置于20 mL頂空瓶中。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動樣品處理及進樣系統設置萃取時間為30 min，分別考察溫度為45，60，75,90 ℃條件下的萃取效果。不同萃取溫度條件下13種有機磷農藥的峰面積見圖2。絕大多數有機磷農藥的色譜峰面積隨萃取溫度升高而增大，因為升高溫度可以增大擴散系數，加速有機磷的揮發，但是升溫會導致分配系數降低，影響萃取纖維對目標物的吸附，降低萃取效率，溫度過高也會導致甲拌磷分解。綜合考慮后，選擇75 ℃為萃取溫度。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響

2.2.2 萃取時間優化

取1 mL工作溶液置于20 mL頂空瓶中。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動樣品處理及進樣系統設置萃取溫度為75 ℃，分別考察萃取 30 ，45 ，60 ，75 ，90 min 時的萃取效果。不同萃取時間條件下13種有機磷農藥的峰面積見圖3。除二嗪磷外，其余有機磷的色譜峰面積在45～90 min范圍內變化不大，表明萃取45 min時，有機磷在樣品基質、頂空氣體以及纖維涂層這三相中轉移基本平衡。考慮到時間成本，選擇萃取時間為45 min。

圖3 萃取時間對萃取效果的影響

2.2.3 樣品體積優化

分別取 0.5，1 ，2 mL工作溶液置于 20 mL頂空瓶中。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動樣品處理及進樣系統設置萃取溫度為75 ℃，萃取時間為45 min，不同樣品體積下13種有機磷農藥的峰面積見圖4。在其他條件不變的情況下，樣品體積增大，SPME的萃取相中樣品絕對量增加，可以提高檢測方法的靈敏度。但是當樣品體積超過2 mL時，頂空萃取過程的劇烈振蕩會導致萃取頭接觸到液體樣品，減小萃取頭的使用壽命。因此選擇樣品體積為2 mL。

圖4 樣品體積對萃取效果的影響

2.2.4 離子強度優化

取兩份2 mL工作溶液分別置于20 mL頂空瓶中，一份中加入過量NaCl使溶液達到飽和狀態。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動樣品處理及進樣系統設置萃取溫度為75 ℃，萃取時間為45 min，不同鹽濃度條件下13種有機磷農藥的峰面積見圖5。加入過量NaCl使樣品達到飽和狀態后，可將樣品間離子強度的差異降至最低，使有機磷農藥在水溶液中的溶解度下降，分配系數增大，方法靈敏度提高[16]。因此選擇加入過量NaCl使樣品達到飽和狀態。

圖5 離子強度對萃取效果的影響

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系、檢出限和定量限

根據MRM掃描方式下各待測物的儀器響應值，用一級水稀釋配制質量濃度分別為0.01，0.1，1，2，5，10，15，20 ng/mL滅線磷、治螟磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、二嗪磷、毒死蜱和 0.05，0.1，1，10，20，50，100，200 ng/mL敵敵畏、甲拌磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、對硫磷、殺撲磷的混合標準工作溶液，按優化后的全自動在線頂空固相微萃取條件和儀器條件進行萃取分析。以3倍和10倍信噪比（S/N）計算各目標物的檢出限和定量限，以各目標物的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果見表3，13種有機磷農藥的檢出限為0.002～0.5 ng/mL，定量限為0.006～1.8 ng/mL，且在線性范圍內標準曲線的相關系數均大于0.99，線性關系良好。

表3 13種有機磷農藥的線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限與定量限

2.3.2 精密度

根據MRM掃描方式下各待測物的儀器響應值，各目標物分別設置低、中、高3個濃度，每個濃度平行測定6個樣品，按上述優化的萃取方法和儀器條件進行萃取分析，結果見表4。3種濃度下13種有機磷農藥的精密度在1.92%～17.10%之間。樣品在加熱模塊中升溫并不斷振蕩進行萃取時，樣品瓶壁可能會吸附部分目標物，尤其當基質中目標物濃度較低時，瓶壁的吸附作用會對精密度產生較大影響。

表4 13種有機磷農藥的精密度

3 結束語

實驗建立的全自動在線HS-SPME對于魚塘水樣中的有機磷農藥具有良好的提取效果，方法僅需2 mL魚塘水樣品，無需使用有機溶劑，綠色環保，萃取步驟為程序設定的全自動化操作，平行性好，且萃取模塊直接搭載在氣質聯用儀上方，樣品處理完畢直接進樣測試，整個過程不到1.5 h，且后續樣品能智能計算萃取和進樣時間，實現了前處理分析一體化的功能，為公安機關檢測魚塘水中的有機磷農藥提供了參考。