1株可提高植物耐鹽能力菌株的分離

談 峰，王 瑩，李玉娟

(江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇 南通 226541)

鹽堿土的改良途徑有很多，但是重鹽堿地的改良必先從高耐鹽植物的種植開始，而林木的利用是最高效的。但在自然界中可供利用的高耐鹽林木資源極其匱乏，改良林木的耐鹽性是一個重要的擴展資源的途徑，育種改良固然是一個可行的途徑，但其周期長、效率低，目前的研究認為可以通過利用改良基質先行以提高植物耐鹽性，進而在土壤中實際應用少量基質而達到讓低耐鹽樹種在中高含鹽量土地上存活并逐步適應生長[1]，而在這個技術途徑中的一個關鍵因子是高耐鹽菌株及其可利用途徑的獲得。

自然界中高耐鹽微生物是存在的，主要以土壤生境和植物內生生境的方式存在，而針對研究目的而言，植物內生耐鹽菌是首選的研究對象，尤其以植物內生耐鹽細菌為優。

植物內生細菌(Endophytic bacteria)是指能在健康植物組織內棲居，而對植物不造成任何實質性危害的微生物[2]。從植物根瘤菌的開發應用到茯苓的大規模人工栽培，無不表現出植物共生菌在人類改造自然、應用自然中的主觀能動性的積極作用。在提高植物對鹽堿條件的適應性方面，共生菌也存在天然的優勢。有研究表明，內生細菌能夠促進植物生長、促進生物固氮、增強宿主抗病蟲害、抗逆能力等。Mason發現鹽漬土植物共生菌對改進植物在鹽漬土上的生長，提高植物耐鹽性有著極大的作用[3]。Gupta等發現在鹽脅迫下對玉米接種AM真菌在不施用磷肥的條件下與不接種AM真菌但施用磷肥的植株生長量相當[4]。植物體內外存在大量種類豐富、功能多樣的微生物。近年來，高通量測序等多種組學技術的發展揭示了植物地下微生物群體的菌群結構和功能，從生態和進化角度去探討植物的耐鹽策略備受關注。井大煒等研究發現，在一些鹽生植物中也含有這些有類似功能的菌，如嗜鹽菌，而這些菌是具有增強植物耐鹽力的能力的[5]。Bu等研究發現，內生菌可以有效保護水稻葉片保護酶系統，從而提高水稻的耐鹽堿性[6]。在研究特定基質時，魏琦等通過對一些植物的特定共生菌的研究發現，某些植物在接種了特定耐鹽菌后[7]，植物的生長，尤其是在不良條件下的生長能力得到了極大的提高。筆者在篩選高耐鹽菌的過程中，從海灘淺水和瀕水植物中分離提純高耐鹽微生物，最終在淺水大米草的根系內部發現了一株高耐鹽的菌株，經過系統的試驗研究，結果顯示其具有提高植物耐鹽性的功能，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離材料 攜菌植株：大米草(SpartinaanglicaHubb.)樣本在江蘇如東海灘淺水處取得，挖取過程中保留完整根系，在海水中洗去泥沙，封存備用。

1.1.2 高鹽PDA培養基 高鹽PDA培養基：海水(含鹽2%)1000 mL、土豆200 g、瓊脂14 g、牛肉浸膏12 g、精解蛋白胨10 g。按常規PDA培養基制作方法制作，裝試管，125 ℃下滅菌25 min，擺斜面。擴大培養試驗以培養皿為容器。

育苗基質：配料為木腐菌糠30%、秸稈20%、雙孢蘑菇菌糠50%、菌糠料和秸稈料拌和均勻，腐熟發酵；配以鹽濃度2%的選菌發酵液，最后培養料的含鹽量調至0.6%供試驗用。

1.2 方法

1.2.1 內生菌的分離與純化 取植株的根系，經過無菌水沖洗，截取尖端組織，在無菌條件下經過無菌操作，取根尖內部組織于試管中，30 ℃下無菌培養。將分離獲得的不同菌株分別培養，提純培養，得到純化的菌株。

1.2.2 微生物形態 通過對微生物個體及菌落的形態觀察，初步界定菌物分類地位。

1.2.3 菌株對提高植物耐鹽性的初步鑒定 以獲得的菌株單菌落擴大培養，制成以獲得菌為主導群的特殊基質，以杜梨為試驗植物，檢驗菌物對提高植物耐鹽能力的作用，確定內生菌對杜梨耐鹽性的影響,選定適合菌株。

以28 cm×17 cm花盆為容器移栽杜梨，根部分洗凈處理。每樣本50株，地徑1 cm，定高50 cm，全去葉，以含鹽2%的海水噴霧基質表面保持基質濕潤。記錄植株發芽的情況。生長穩定后，取樣測量根系萌發數量與生長長度，以根系萌發并健康生長為指標來確定杜梨是否成活。

1.2.4 菌株鑒定 以表現優良者，擴大培養，顯微鏡觀察菌落形態。以基因測序的方法鑒定菌株分類地位。

革蘭氏染色、基因測序鑒定。測定步驟：基因組抽提、PCR擴增、測序、物種鑒定。內生菌的16S DNA片段分析。

采用蛋白酶K裂解的方法進行基因組DNA抽提，以8F(5′)AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R(3′)TACGGYTACCTTGTTAYGACTT為引物進行PCR擴增。表1～表3為測序所用的標準物。

PCR產物檢測:取3 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定結果是否可以用于測序。

表2 PCR體系

表3 PCR程序

1.3 耐鹽能力的鑒定

按含鹽度2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%設置PDA培養基,培養皿培菌，接種菌株，30 ℃無菌培養，觀察、記錄菌株生長情況，判定菌株的耐鹽能力。

2 結果與分析

利用植物根尖內部組織切片置于專業培養基上培養，獲得菌株，經過反復分離提純，獲得3個不同表現的細菌菌株——B1、B2、B3,結果見圖1。分離的結果說明，在淺海水環境下生活的植物體內含有耐鹽菌，這類菌物能與植物在鹽生條件下共同生長，并不會造成對植物的傷害。

2.1 具備促進植物在鹽生條件下的菌株選擇

經過擴大培養，制成含耐鹽菌的3個基質，經過裸根移栽杜梨的試驗，證明有1個菌株具有提高植物耐鹽性的功能，標記為B2，結果見表4。

表4 3個菌株對杜梨在鹽生條件下生根率的影響

試驗的結果說明，并不是所有的植物內生耐鹽菌都具有促進植物在鹽生條件下生根成活的能力的，B2菌具有較高的提高植物耐鹽性的能力。

B2菌的耐鹽能力：通過對B2菌在不同含鹽濃度的培養皿中的試驗研究，結果顯示，B2菌可以在飽和鹽濃度以下和基質中正常生長發育，區別是菌株恢復生長的時間不同，結果見表5。這說明B2菌是一株極度耐鹽的菌株。

表5 B2菌在不同鹽濃度條件下的生長時間

在得到初步結果后，又對10%和15%鹽濃度間進一步分級試驗，結果在鹽濃度達到13%時，菌株恢復生長時間開始延長。由此說明，在不同鹽濃度條件下，當菌株恢復生長后，生長速度不再受鹽濃度的影響。

2.2 B2菌的鑒定

以接種環取菌，劃線培養，結果顯示：菌落乳白色，圓珠狀(圖1)。在顯微鏡下觀察，單細胞形態為無色，長卵圓形，頂側芽分裂生長，對比形態，屬于細菌類(圖2)。B2菌株革蘭氏染色結果為紅色，說明為陰性菌。

2.3 測序結果

16S V1～V9片段大小約為1500 bp，雙端測序結果進行拼接，由于測序起始端測序質量較差，所以筆者去除了質量較差的序列。測序結果(圖3、圖4)顯示B2樣本測序峰單一，說明品種單一。

拼接：FLASH v1.2.11 默認參數；質量過濾：seqtk v1.2 默認參數；序列結果見圖5。

2.4 Blast比對結果

經NCBI數據庫比對，結果測試菌株與數據庫中相似性最高的前10位及物種分類信息統計結果見表6。

Pseudomonasplecoglossicida從已知文獻的報道中可以知道是魚類的致病菌[8]，在植物中未見相關報道，Pseudomonastaiwanensis是一種土壤中分離的菌[9]，對砷元素有富集隔離作用，已知同屬中的菌株未見有相同功能的報道，且基因序列不完全重復。

2.5 比對結果物種分類信息的注釋

從表7中所列已知菌株的注冊信息看，本次分離獲得的菌株在Pseudomonas下無相同菌株，所列10個最相近菌株的注冊地位在屬以上完全相同，從基因測序的結果說明，新菌株屬于Pseudomonas屬，種上沒有相同的菌株。

表7 前10個物種的各級別物種信息注釋

2.6 發育樹

B2菌的16S rDNA序列提交至NCBI進行BLAST對比后得到一系列的結果，選取與同源性比對得到的10個同屬不同種相似菌株進行系統發育樹的構建，結果見圖6。

從測序結果的BLAST比對數據中可以看到，10個相近菌株中，測序菌株與NR 115336.1和NR 040859.1兩個編號的菌株關系最遠，相似度99.006%；與NR 114226.1和NR 024662.1關系最近，相似度為99.645%。這首尾的4個菌株的屬分類地位一致，均為Pseudomonas屬，10個相似菌株的比對結果構成新測序菌株的系統發育樹，說明該菌來自于Pseudomonas屬，是一個未見報道的種。

2.7 鑒定結果

基因測序的結果顯示，在物種庫中沒有與所得菌株完全一致的已知菌株，綜合測試的各項指標結果，測試菌株為一個未見注冊的菌株，新獲得菌株極可能是一個新的物種，暫名為PseudomonasG。

表8 菌株測序鑒定結果

3 討論

菌類參與植物生命活動并提高植物抗逆性，促進植物在不良環境下的移栽成活率是客觀的事實，根際菌類是最直接的作用菌[10-12]。外生菌是以改善環境條件的方式作用于植物，而內生菌則是在植物體內以改善植物體自身對不良環境的耐受力而發揮作用的[13]，所以從作用的方式上講，內生菌對外生菌有著更廣泛的應用前景。以鮮活植物為供體分離體內菌株，尋找可以促進植物在鹽生條件下移栽成活的目標菌株，排除了菌株與植物互害的風險，分離菌株的培養基含鹽量為2%。在此基質上生長的菌類在耐鹽能力上屬于高耐鹽菌，由于是采用健康的鮮活植物內部組織分離的技術途徑獲得的菌株，說明所獲得的菌株對植物的生長沒有危害性。極限耐鹽力為0.4%的杜梨，經過在含鹽0.6%、混合了耐鹽菌株的培養基的鑒定性栽培試驗，在含B2菌的基質中生根成活率達84%，其他菌株不能生根成活，證明分離到的新菌株B2具有明顯的提高植物耐鹽能力的作用。通過測序鑒定，在目前已知資料庫中沒有相同的菌株，而相似菌株也未見有類似功能，所以新菌株B2是一個未見報道的新菌株。新菌株鑒定過程中僅做了耐鹽力、對植物在較高鹽濃度條件下提高成活率的試驗研究，但對其作用機理未做深入的研究，對植物耐鹽能力的提高極限也沒有作出深入的研究，這些工作將會在今后的工作中進行。