絞股藍總皂苷經PI3K/Akt/Bax 信號通路對膿毒癥大鼠腦損傷的改善作用

邱名耀吳梅秋張瑋芳林明霞林先萍

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院急診科,海口 570102; 2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院ICU,海口 570102;3.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院腫瘤化療科,海口 570208;4.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血透科,海口 570102)

膿毒癥是重癥監(jiān)護中最重大的挑戰(zhàn)之一,常引起多器官功能障礙,約一半以上患者可能并發(fā)膿毒癥相關性腦病(sepsis associated encephalopathy,SAE),可影響神經功能,引起患者癲癇、昏迷,嚴重者導致死亡。大腦的海馬區(qū)為主要認知功能區(qū),SAE 的發(fā)生與海馬功能區(qū)血管功能障礙、細胞損傷、氧化應激等有關[1-2],其中磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B, Akt)通路與細胞凋亡和氧化應激反應密切相關[3]。Wang 等[4]發(fā)現,外源給予重組人促紅細胞生成素可激活PI3K/Akt 通路,促進Akt磷酸化,降低促凋亡Bad 蛋白表達,進而減輕海馬神經元凋亡,改善 SAE 大鼠腦功能障礙,提示PI3K/Akt 通路可能是SAE 的治療靶標之一。以往臨床上主要采取液體支持及抗生素治療膿毒癥,然而死亡率居高不下,因此,抗氧化等其他方案被逐漸重視。絞股藍總皂苷(gypenosides, GYPs)為提取自傳統(tǒng)中藥絞股藍Gynostemma pentaphyllum的皂苷類物質總稱,具有抗氧化、調節(jié)免疫、抑制炎癥等藥理功能,近年國內外研究發(fā)現,GYPs 可通過降低炎癥因子水平、提高抗氧化活性,有效減輕脂多糖誘導的小鼠炎癥反應,改善帕金森小鼠記憶和學習認知功能[5-6],然而其對SAE 的治療作用尚不清楚。本研究通過盲腸結扎穿孔術建立SAE 大鼠模型并通過分析海馬組織PI3K/Akt 通路蛋白表達,初步探究GYPs 治療SAE 的作用機制,以期為臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 周齡雄性健康 SD 大鼠 69 只,SPF 級,購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0002],體重180 ～200 g,于海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物房[SYXK(粵)2018-0004]常規(guī)飼養(yǎng)1 周,本研究經海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會IACUC 批準(MDK-20190316),并遵守3R 保護原則進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

絞股藍總皂苷(原料藥,純度≥98%,批號:52705-19)購自廣州楊葉生物科技有限公司;PI3K抑制劑GNE-317(純度:99.26%,批號:HY-12763)購自美國 MEC 公司;PI3K、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、凋亡調節(jié)因子Bax 小鼠源抗體(批號:sc-365290、sc-56053、sc-70405)購自美國 Santa cruz 公司;Akt、凋亡調節(jié)因子 Bad、p-Akt 兔源抗體、羊抗 鼠 IgG 二 抗 ( 批 號: ab179463、 ab62465、ab38449、ab205718)購自美國 Abcam 公司;β-actin小鼠源抗體(批號:3700S)購自美國CST 公司;脂質氧化丙二醛(malonydialdehyde,MDA)、蘇木素伊紅(HE)染色、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、TUNEL 凋亡試劑盒(批號:S0131M、C0105、S0101M、C1098) 購自碧云天(上海) 有限公司;PR4100 型酶標儀、1658001 型電泳儀均購自美國BioRad 公司;CX43 型光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;Tanon 4100 型凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠分組及模型制備

參照文獻[7]采用盲腸結扎穿孔術制備SAE 大鼠,術后12 h 血壓明顯降低且腦電圖異常表明SAE模型制備成功。造模過程中7 只死亡,2 只未觀察到腦損傷,共造模成功48 只SAE 大鼠,按隨機數表法分為:SAE 組、GYPs 組,GNE-317 組,GYPs+GNE-317 組,每組12 只。另取12 只大鼠剖腹術后未結扎或刺破,僅撥動盲腸作為假手術(Sham)組。于造模后2 h,GYPs 組灌胃給予200 mg/kg GYPs 溶液(溶劑:0.2% Tween 80 生理鹽水)[8]、GNE-317 組灌胃給予 40 mg/kg GNE-317 溶液(溶劑同上)[9]、GYPs+GNE-317 組灌胃給予200 mg/kg GYPs 溶液+40 mg/kg GNE-317 溶液,灌胃體積2 mL,Sham 組及SAE 組給予等體積生理鹽水,連續(xù)給藥3 d,每天1 次。

1.3.2 反射實驗評價大鼠神經行為

末次給藥12 h 后觀察大鼠一般情況,并分別采用耳廓反射、捏尾反射、角膜反射、逃逸反射、翻正反射對大鼠神經行為進行評分[10]。無反射為0 分,弱反射(10 s 內無反應)為1 分,正常反射為2 分,各項得分相加為總分,最高為10 分。

1.3.3 HE 染色觀察大鼠海馬組織病理損傷

反射實驗結束,腹腔注射100 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,各組隨機取3 只,經心臟依次灌注生理鹽水、含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液后,取腦、分離海馬組織,制備石蠟切片(每片5 μm),部分切片采用HE 試劑盒染色后置于光學顯微鏡下觀察;剩余9 只迅速斷頭取腦、分離海馬組織,生理鹽水洗凈、切碎后裝入凍存管,液氮中速凍1 d 后保存在-80℃冰箱。

1.3.4 TUNEL 實驗檢測大鼠海馬中細胞凋亡情況

取1.3.3 中海馬切片,按照TUNEL 試劑盒說明書,依次處理切片,最后用蘇木精復染色,置于光學顯微鏡下觀察。

1.3.5 試劑盒檢測海馬組織 MDA 水平和 SOD活性

取出1.3.3 中冷凍海馬組織,加入磷酸緩沖液于冰上勻漿,離心收集上清液,按照MDA、SOD 試劑盒說明書依次加入工作液孵育后,分別于535 nm、450 nm 處檢測各孔吸光值,對照標準曲線計算各樣品中MDA 水平和SOD 活性。

1.3.6 免疫印跡法(Western blot)檢測海馬組織PI3K/Akt/Bax 通路蛋白表達情況

取出1.3.3 中冷凍海馬組織,采用液氮研磨法粉碎,加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液,提取其中蛋白質。BCA 法測定蛋白濃度后,分別取20 μg蛋白與5×SDS 上樣緩沖液混勻并煮沸,經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,依次轉膜、洗膜,5%質量分數脫脂牛奶封閉 1 h,加入 PI3K、Akt、Bax、p-Akt、Bad、caspase-3 及 β-actin 一抗(稀釋倍數均為 1 ∶1000)孵育過夜,然后加入羊抗鼠IgG 二抗(1 ∶5000稀釋)孵育2 h,洗膜后加入增強化學發(fā)光液,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學分析,計量數據均采用平均數±標準差(±s)表示,多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GYPs 對大鼠海馬組織病理損傷的影響

Sham 組大鼠海馬神經元可見正常的形態(tài),具有完整細胞核、囊泡核等結構;SAE 組大鼠海馬大部分核染色質皺縮成團塊,細胞質凝縮,細胞碎裂,表現為彌漫性神經元損傷;GYPs 組大鼠海馬神經元損傷明顯減輕,形態(tài)趨于正常;GNE-317 組大鼠海馬神經元損傷比SAE 組更嚴重;GYPs+GNE-317 組大鼠海馬神經元總體形態(tài)同SAE 組相似,比GYPs 組嚴重。見圖1。

2.2 GYPs 對大鼠一般情況及神經行為評分的影響

Sham 組大鼠毛色正常,飲食及活動等一般情況良好;SAE 組大鼠毛色無光澤,表現出嗜睡、自發(fā)活動缺乏、肢體協調降低等癥狀;GYPs 組大鼠毛色趨于正常,活動增加。相較于Sham 組,SAE 組大鼠神經行為評分降低(P<0.05);GNE-317 組大鼠一般情況比 SAE 組更差;GYPs+GNE-317 組同 SAE 組相近。相較于SAE 組,GYPs 組大鼠神經行為評分增高,GNE-317 組降低(P<0.05);相較于 GYPs 組,GYPs+GNE-317 組大鼠神經行為評分降低(P<0.05);相較于 GNE-317 組,GYPs+GNE-317 組大鼠神經行為評分增高(P<0.05)。見表1。

2.3 GYPs 對大鼠海馬組織細胞凋亡的影響

Sham 組、SAE 組、GYPs 組、GNE-317 組、GYPs+GNE-317 組大鼠海馬凋亡細胞比例依次為(8.12±0.59)%、 (29.87 ± 3.39)%、 (11.34 ± 2.76)%、(41.08±3.81)%、(27.61±3.54)%,相較于 Sham組,SAE 組大鼠凋亡細胞比例增高(P<0.05);相較于SAE 組,GYPs 組大鼠凋亡細胞比例降低,GNE-317 組增高(P<0.05);相較于 GYPs 組,GYPs+GNE-317 組大鼠凋亡細胞比例增高(P<0.05);相較于GNE-317 組,GYPs+GNE-317 組大鼠凋亡細胞比例降低(P<0.05)。見圖2。

2.4 GYPs 對大鼠海馬組織MDA 水平及SOD 活性的影響

相較于Sham 組,SAE 組大鼠MDA 水平增高、SOD活性減弱(P<0.05);相較于SAE 組,GYPs 組大鼠MDA水平降低、SOD 活性增強,GNE-317 組MDA 水平增高、SOD 活性減弱(P<0.05);相較于GYPs 組,GYPs+GNE-317 組大鼠 MDA 水平增高、SOD 活性減弱(P<0.05);相較于GNE-317 組,GYPs+GNE-317 組大鼠MDA 水平降低、SOD 活性增強(P<0.05)。見表2。

2.5 GYPs 對大鼠海馬組織PI3K/Akt 通路蛋白表達的影響

相較于 Sham 組,SAE 組大鼠 PI3K 蛋白及 p-Akt 水平降低,cleaved-caspase-3、Bax、Bad 蛋白表達增高(P<0.05);相較于SAE 組,GYPs 組大鼠PI3K蛋白及 p-Akt 水平增高,GNE-317 組降低(P<0.05),cleaved-caspase-3、Bax、Bad 蛋白表達降低,GNE-317 組增高(P<0.05);相較于 GYPs 組,GYPs+GNE-317 組大鼠 PI3K 蛋白及 p-Akt 水平降低,cleaved-caspase-3、Bax、Bad 蛋白表達增高;相較于GNE-317 組,GYPs+GNE-317 組 PI3K 蛋白及 p-Akt水平增高,cleaved-caspase-3、Bax、Bad、蛋白表達降低(P<0.05)。見表3、圖3。

注:圖中黑色箭頭所指為損傷神經元。圖1 大鼠海馬組織HE 染色Note.The black arrows indicate the damaged neurons.Figure 1 HE staining of rat’s hippocampus

注:圖中黑色箭頭所指為TUNEL 陽性細胞即凋亡細胞。圖2 大鼠海馬組織TUNEL 染色Note.The black arrows indicate TUNEL positive apoptotic cells.Figure 2 TUNEL staining of rat’s hippocampus

表1 5 組大鼠神經行為評分比較( ±s,n=12)Table 1 Comparison of rat’s neurobehavior scores of 5 groups

表1 5 組大鼠神經行為評分比較( ±s,n=12)Table 1 Comparison of rat’s neurobehavior scores of 5 groups

注:與Sham 組比較,aP<0.05;與SAE 組比較,bP<0.05;與GYPs 組比較,cP<0.05;與GNE-317 組比較,dP<0.05。Note.Compared with Sham group, aP<0.05.Compared with SAE group, bP<0.05.Compared with GYPs group, cP<0.05.Compared with GNE-317 group, dP<0.05.

組別Groups神經行為評分(分)Neurobehavioral score (score)Sham 組Sham group 10.00±0.00 SAE 組SAE group 6.13±0.41a GYPs 組 GYPs group 8.36±0.55b GNE-317 組 GNE-317 group 4.71±0.23bc GYPs+GNE-317 組 GYPs+GNE-317 group 6.06±0.43cd

表2 5 組大鼠海馬組織MDA 水平及SOD 活性比較( ±s,n=9)Table 2 Comparison of MDA level and SOD activity in rat’s hippocampus of 5 groups

表2 5 組大鼠海馬組織MDA 水平及SOD 活性比較( ±s,n=9)Table 2 Comparison of MDA level and SOD activity in rat’s hippocampus of 5 groups

注:與Sham 組比較,aP<0.05;與SAE 組比較,bP<0.05;與GYPs 組比較,cP<0.05;與GNE-317 組比較,dP<0.05。Note.Compared with Sham group, aP<0.05.Compared with SAE group, bP<0.05.Compared with GYPs group, cP<0.05.Compared with GNE-317 group, dP<0.05.

組別Groups MDA(μmol/mg) SOD(U/mg)Sham 組 Sham group 4.42±0.91 103.05±8.64 SAE 組 SAE group 16.26±1.53a 81.24±7.25a GYPs 組 GYPs group 9.17±1.68b 196.63±9.57b GNE-317 組 GNE-317 group 27.04±9.52bc 72.32±5.06bc GYPs+GNE-317 組 GYPs+GNE-317 group 15.52±2.08cd 80.17±9.43cd

表3 5 組大鼠海馬組織PI3K/Akt 通路蛋白表達比較( ±s,n=9)Table 3 Comparison of PI3K/Akt pathway protein expression in rat’s hippocampus of 5 groups

表3 5 組大鼠海馬組織PI3K/Akt 通路蛋白表達比較( ±s,n=9)Table 3 Comparison of PI3K/Akt pathway protein expression in rat’s hippocampus of 5 groups

注:與Sham 組比較,aP<0.05;與SAE 組比較,bP<0.05;與GYPs 組比較,cP<0.05;與GNE-317 組比較,dP<0.05。Note.Compared with Sham group, aP<0.05.Compared with SAE group, bP<0.05.Compared with GYPs group, cP<0.05.Compared with GNE-317 group, dP<0.05.

組別Groups PI3K p-Akt/Akt cleaved-caspase-3/caspase-3 Bax Bad Sham 組 Sham group 0.98±0.05 0.83±0.03 0.09±0.01 0.21±0.02 0.36±0.03 SAE 組 SAE group 0.51±0.04a 0.47±0.02a 0.38±0.03a 0.49±0.03a 0.56±0.04a GYPs 組 GYPs group 0.65±0.05b 0.89±0.04b 0.07±0.01b 0.25±0.01b 0.18±0.02b GNE-317 組 GNE-317 group 0.32±0.04bc 0.22±0.01bc 0.87±0.03bc 0.59±0.02bc 1.21±0.05bc GYPs+GNE-317 組 GYPs+GNE-317 group 0.49±0.02cd 0.45±0.02cd 0.35±0.03cd 0.43±0.03cd 0.54±0.04cd

注:A:Sham 組;B:SAE 組;C:GYPs 組;D:GNE-317 組;E:GYPs+GNE-317 組。圖3 大鼠海馬組織PI3K/Akt 通路蛋白印記圖Note.A, Sham group.B, SAE group.C, GYPs group.D, GNE-317 group.E, GYPs+GNE-317 group.Figure 3 Western blot of PI3K/Akt pathway-related protein in rat’s hippocampus

3 討論

隨著醫(yī)學的進步,重癥監(jiān)護室中病人存活率逐年增高,然而膿毒癥尤其是SAE 依然為導致死亡的重要因素,因此尋找可有效治療SAE 的藥物很有必要。本研究通過盲腸結扎穿孔術模擬膿毒癥發(fā)生過程,結果發(fā)現SAE 組血壓明顯降低且腦電圖異常,毛色無光澤,嗜睡,自發(fā)活動、肢體協調及神經行為評分降低,表明SAE 模型制備成功。腦病理學發(fā)現,SAE 可導致腦組織出現白質出血和血凝過多,微膿腫形成,橋腦中樞髓鞘溶解,代謝變化,缺血性變化和細胞凋亡等損傷[11]。另有研究發(fā)現,SAE 大鼠腦損傷與氧化損傷和細胞凋亡密切相關[12]。本研究結果顯示,Sham 組大鼠海馬神經元細胞核、囊泡核等完整,形態(tài)正常,SAE 組大鼠海馬核染色質皺縮成團塊,細胞碎裂,出現彌漫性神經元損傷,且相較于Sham 組,SAE 組海馬中凋亡細胞比例及MDA 水平增高,SOD 活性減弱,表明SAE 大鼠海馬組織處于高水平氧化應激狀態(tài),細胞結構異常,凋亡增加。據《中華本草》記載絞股藍具有增強體液和細胞免疫、抗氧化、改善脂質代謝、保護中樞神經等作用,被廣泛用作長期治療多種疾病的安全有效天然草藥,具有較高口服生物利用度且可穿越血腦屏障進入大腦發(fā)揮作用[13]。Keilhoff 等[14]在心肺復蘇模型大鼠中研究發(fā)現,GYPs 可增強海馬區(qū)神經元活力,激活呼吸鏈,保護心臟驟停引起的神經元死亡。本研究結果顯示,給于 GYPs 后,GYPs 組大鼠海馬神經元損傷明顯減輕,形態(tài)趨于正常,凋亡細胞比例及MDA 水平降低,神經行為評分及SOD 活性增強,表明GYPs 可降低海馬組織氧化應激水平,減少細胞凋亡,改善神經功能,減輕腦損傷。

PI3K 為p85 調節(jié)亞基和p110 催化亞基組成一種異聚蛋白質,可催化許多下游激酶(如Akt)磷酸化,活化后的Akt 可調節(jié)細胞增殖、細胞骨架組織、囊泡轉運、細胞代謝、氧化應激等生物過程;還可抑制Bad、Bax 等促凋亡蛋白轉錄翻譯,抑制凋亡。研究發(fā)現,病原物感染可導致腦部炎癥反應,腦內PI3K 水平降低,影響PI3K/Akt 通路活性,進而影響腦內神經元等多種細胞的代謝和存活[15]。過往研究發(fā)現,膿毒癥與PI3K/Akt 通路抑制、細胞凋亡及氧化應激增加有關[16-18]。本研究中,相較于Sham組,SAE 組大鼠海馬中 PI3K 蛋白及 p-Akt 水平降低,cleaved-caspase-3、Bax、Bad 蛋白表達增高,進一步表明SAE 大鼠海馬組織中PI3K/Akt 通路被抑制,且下游促凋亡因子水平升高。研究發(fā)現,神經珠蛋白可通過激活PI3K 蛋白,增加Akt 磷酸化,抑制Bax 蛋白釋放,逆轉膿毒癥誘導的大鼠腦損傷[19]。Yin 等[20]亦發(fā)現,通過激活 AKT 信號通路,右美托咪定可抑制神經元損傷,保護SAE 大鼠神經功能。以上研究提示PI3K/Akt 通路可能為治療SAE 的靶標。本研究中發(fā)現,給予GYPs 治療后,大鼠海馬組織中 PI3K 蛋白及 p-Akt 水平增高,cleaved-caspase-3、Bax、Bad 蛋白表達降低,推測GYPs 對SAE 大鼠腦損傷的改善作用與促進PI3K/Akt 通路激活,抑制促凋亡因子釋放有關。進一步研究顯示,相較于GPYs 組,GYPs+GNE-317 組大鼠海馬組織損傷嚴重,神經行為評分、SOD 活性、PI3K蛋白及p-Akt 水平降低,凋亡細胞比例、MDA 水平cleaved-caspase-3、Bax、Bad 蛋白表達增高,表明PI3K 抑制劑 GNE-317 可阻滯 GYPs 對 PI3K/Akt 通路的激活作用,抵抗其對SAE 大鼠的保護作用。

綜上所述,GYPs 可促進海馬PI3K/Akt 通路活化,抑制下游促凋亡因子釋放,降低氧化應激,改善SAE 大鼠腦損傷,另外GYPs 副作用少,可能應用于臨床治療SAE。然而SAE 進展迅速,機制復雜,過程中涉及多種通路,GYPs 對SAE 的治療作用可能涉及其他機制,值得進一步探討。