基于UPLC-Q-TOF-MS技術的霍山野生及栽培赤芝的代謝組學分析△

韓曉靜，于大慶，單婷玉，徐睿，查良平*，楊健

1.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥 2300122.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700

赤芝最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，謂其“益心氣，補中，增慧智不忘”[1]。據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版記載，靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.或紫芝G.sinenseZhao的子實體[2]。關于赤芝的產(chǎn)地，《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]、《本草綱目》[3]中均有記載：“赤芝生霍山”。霍山地處于大別山北麓南北交界處，地理位置優(yōu)越，氣候溫和濕潤。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有抗腫瘤、調(diào)血脂、抗氧化等作用[4-6]。隨著靈芝的藥用價值不斷被發(fā)掘，野生資源遠不夠提供日益增長的市場需求，栽培赤芝隨之大規(guī)模出現(xiàn)。越來越多的學者開始致力于野生靈芝和栽培靈芝活性成分的研究[7-8]。本課題組前期運用顯微技術對霍山赤芝野生品和栽培品的外觀性狀和內(nèi)部構造進行了系統(tǒng)比較[9]，但其活性成分是否存在差異尚不明確。

代謝組學是以生物系統(tǒng)中的代謝產(chǎn)物為對象，通過高通量、高靈敏度、高分辨率的現(xiàn)代儀器，結合統(tǒng)計分析方法，分析生物體代謝產(chǎn)物變化規(guī)律[10]。近年來，代謝組學方法和技術被廣泛地運用于中藥現(xiàn)代化研究中，尤其是中藥活性成分研究、中藥整體藥效評價、中藥炮制機制研究和中藥安全性研究等方面[11-13]。目前，超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)技術常結合主成分分析(PCA)及聚類分析等方法，用于中藥材質(zhì)量的評價，且能對差異物質(zhì)進行定性鑒定。白璐等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS代謝組學技術研究遠志不同品種間的化學成分差異，并篩選出13個差異代謝物。韓正洲等[15]基于UPLC-Q-TOF-MS建立了栽培型和野生型菊花的化學成分分析，表明兩者的化學組成存在差異，并篩選出木犀草素等9種差異化學成分。

本研究利用UPLC-Q-TOF-MS探尋霍山野生赤芝、仿野生赤芝和栽培赤芝的代謝組學差異，并對野生赤芝和栽培赤芝之間的差異代謝化合物進行定性鑒定，以期為進一步評價和鑒別栽培赤芝和野生赤芝的品質(zhì)提供參考。

1 材料

1.1 試藥

霍山赤芝栽培品“霍芝一號”、仿野生品來自于安徽霍山衡濟堂公司(安徽霍山縣黑石渡鎮(zhèn))，野生品來自安徽霍山大別山區(qū)。每類樣品均選5株，共15批樣品，對其菌蓋和菌柄分別進行打粉。樣品經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥資源中心金艷副研究員鑒定，均為多孔菌科靈芝屬真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.。樣品編號中W表示野生，Ⅰ表示仿野生，C表示栽培，P表示菌蓋，S表示菌柄。WP1～WP5和WS1～WS5分別表示野生赤芝1～5號的菌蓋和菌柄，IP1～IP5和IS1～IS5分別表示仿野生赤芝1～5號的菌蓋和菌柄，CP1～CP5和CS1～CS5分別表示栽培赤芝1～5號的菌蓋和菌柄。

對照品靈芝酸C2(批號：98296-48-1)、赤芝酸A(批號：95311-94-7)均購自上海源葉生物科技有限公司；靈芝酸D(批號：108340-60-9)購自上海同田生物技術股份有限公司，以上對照品純度≥98%。色譜純甲醇、乙腈、甲酸(天津市康科德科技有限公司)。

1.2 儀器

ACQUITY UPLCTM I-Class系統(tǒng)(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、EmpowerTM3型色譜工作站)、Xevo G2-S型Q-Tof四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；JK-5200B型超聲波清洗器(合肥金尼克機械制造有限公司)；EX225DZH型準微量天平(奧豪斯儀器常州有限公司)；Legend Micro 21R型高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；Direct-Pure型純水機(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取干燥的栽培及野生、仿野生赤芝樣品粉末(過三號篩)各0.1 g，精密稱定，置2.0 mL離心管中，加入80%甲醇1.0 mL，密封，超聲提取40 min，4000 r·min-1離心10 min(離心半徑為6 cm)，取上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取靈芝酸C2、靈芝酸D、赤芝酸A對照品適量，加80%甲醇超聲溶解并定容，分別配制成含靈芝酸C2 1.15 mg·mL-1、靈芝酸D 1.03 mg·mL-1、赤芝酸A 1.08 mg·mL-1的混合對照品儲備液，存放于4 ℃冰箱中備用，臨用時用0.22 μm濾膜濾過。

2.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18型色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，20%～35%B；2～13 min，35%～50%B；13～18 min，50%～90%B)；運行時間：18 min；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；分別采用正、負離子模式；掃描質(zhì)量數(shù)：m/z50～1500；碰撞氣體：氬氣；碰撞能量：60～90 eV；數(shù)據(jù)采用MakerLynx軟件處理。

2.5 方法學考察

2.5.1精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)重復進樣6次，按2.3和2.4項下色譜和質(zhì)譜條件進行檢測，分別對各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察，計算RSD。

2.5.2穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h按2.3和2.4項下色譜和質(zhì)譜條件進行檢測，分別對各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察，計算RSD。

2.5.3重復性試驗 取霍山赤芝栽培品“霍芝一號”批次的赤芝樣品共6份，分別按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3和2.4項下色譜和質(zhì)譜條件進行檢測，分別對各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察，計算RSD。

2.6 霍山野生及栽培赤芝代謝組數(shù)據(jù)采集

采集霍山野生及栽培赤芝樣品共30個，按2.1項下方法制備供試品溶液，以2.3和2.4項下方法進行UPLC-Q-TOF-MS測試，采集代謝組數(shù)據(jù)。

2.7 數(shù)據(jù)處理及多變量分析

UPLC-Q-TOF-MS采集獲得的原始數(shù)據(jù)(.raw)導入Progenesis QI(Waters Corp.公司)提取數(shù)據(jù)，該軟件包能夠自動完成譜峰識別、濾噪等前處理程序，最終輸出保留時間、精確質(zhì)荷比組成的譜峰索引(變量)和峰強度/面積的三維數(shù)據(jù)矩陣。為校正質(zhì)譜響應，每個樣品的總峰面積以Pareto標度換算；標準化后的數(shù)據(jù)以SIMCA-P 11.5軟件進行PCA，通過S-Plot判斷樣本的整體分布趨勢。

2.8 霍山野生及栽培赤芝差異代謝物的定性鑒定

經(jīng)Progenesis QI完成譜峰識別、匹配后，以SIMCA-P 11.5軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，尋找霍山野生及栽培赤芝的組間標志代謝物；并對標志代謝物(差異代謝物)的結構進行定性鑒定，以TOF-MS獲得的準分子離子峰精確相對分子質(zhì)量信息、MS/MS獲得的二級碎片信息并結合保留時間與相應對照品進行比對，最終確定差異代謝物的結構。

3 結果

3.1 赤芝代謝組學數(shù)據(jù)采集方法的建立

基于UPLC-Q-TOF-MS技術對赤芝代謝物進行正、負離子掃描，2種模式下的總離子流圖顯示，供試品中各化學組分在不同掃描模式下響應強度不一，但總體上負離子模式下響應峰較多，故采取負離子模式采集赤芝代謝組數(shù)據(jù)，見圖1。

圖1 赤芝80%甲醇水提取物總離子流圖(負離子模式)

3.2 方法學考察結果

3.2.1精密度試驗 對重復進樣6次的供試品溶液色譜測定結果進行計算。結果顯示，各主要共有峰相對保留時間RSD為0.05%～0.36%，相對峰面積RSD為0.12%～1.68%，表明整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。

3.2.2穩(wěn)定性試驗 對相隔時間連續(xù)進樣6次的供試品溶液色譜測定結果進行計算。結果顯示，各主要共有峰相對保留時間的RSD為0.22%～0.85%，相對峰面積的RSD為0.49%～2.81%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.2.3重復性試驗 對方法重復性進行考察。結果顯示，各主要共有峰相對保留時間的RSD為0.44%～1.76%，相對峰面積的RSD為0.59%～2.86%，表明該方法的重復性良好，符合植物代謝組學測定方法的要求。

3.3 霍山野生及仿野生、栽培赤芝代謝組PCA

通過UPLC-Q-TOF-MS采集得到的代謝組學信息數(shù)據(jù)具有樣品量多、數(shù)據(jù)信息復雜以及多維數(shù)據(jù)矩陣內(nèi)各變量之間具有高度相關性等特點，如何從這些“大數(shù)據(jù)”中篩選得到需要的信息，計算方法的選擇至關重要。PCA又稱主分量分析，是將多個具有復雜關系的變量通過線性變換從中篩選出較少個數(shù)重要變量的多元統(tǒng)計分析方法。“降維”是PCA的基本思想，其原則是將很多有相關性的指標，組合成新的互相無關的綜合指標，從而來替代之前的指標；保持之前的所有變量，盡量建立較少的新變量，讓這些新變量既互不相關又能保持之前的信息，從而反映出統(tǒng)計對象原有的“面貌”。本研究中，采用PCA對原始指標進行綜合，即以較少個數(shù)的主成分來反映原始指標的主要信息；觀察實驗模型中的組建分離趨勢，判斷其離合“面貌”。

從PCA得分圖(圖2)可以看出，在t[2]方向，WS1～WS5、WP1～WP5與IP1～IP5、IS1～IS5和CP1～CP5、CS1～CS5呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，表明其代謝組之間存在顯著差異；IP、IS與CP、CS代謝組間差較小。在t[1]方向，野生赤芝、仿野生赤芝及栽培赤芝的菌柄與菌蓋之間均表現(xiàn)出顯著差異，表明赤芝不同部位之間的化學成分亦存在較大差異。其三維得分圖見圖3。

圖2 霍山野生赤芝、仿野生赤芝及栽培赤芝代謝組PCA得分圖

圖3 霍山野生赤芝、仿野生赤芝及栽培赤芝代謝組三維空間分布

3.4 霍山野生及栽培赤芝差異代謝物的定性鑒定

在預先知道樣本分類的情況下，可以將這些先驗的類別信息整合到模式識別中，構建有監(jiān)督的模式識別方式，通過綜合運用類別指導信息和預處理后的變量集，篩選出有效的分類信息。偏最小二乘法(PLS)是一種新型的多因變量對多自變量的多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析方法，由于生物代謝物監(jiān)測數(shù)據(jù)的復雜性、不確定性和模糊性，經(jīng)常在實施PLS之前對數(shù)據(jù)進行冗余處理；OPLS-DA就是應用廣泛且有效的一種監(jiān)督性模式識別方法。該方法在PLS的基礎上，預先將X矩陣的每一列，即每一個變量與指導向量Y做相關分析。與Y相關性小，或正交的變量被認為對Y指導下的分類的貢獻可以忽略，建模時不采用。與Y相關性足夠大的變量被保留，用于建模。

如圖4所示，經(jīng)過正交去噪后的監(jiān)督性分析方法OPLS-DA可更加明顯地區(qū)分霍山野生和栽培赤芝，模型的R2X、R2Y和Q2分別為0.289、0.953和0.822。組間差異代謝物的標記通過下述4個標準：1)變量投影重要性(VIP)>2.0；2)相關系數(shù)(r)>0.80；3) Mann-Whitney非參數(shù)檢驗的P<0.001；4)曲線下面積(AUC)> 0.8。

圖4 霍山野生赤芝和栽培赤芝的OPLS-DA

如圖5所示，矩形框內(nèi)的為霍山野生和栽培赤芝的差異代謝物。通過TOF-MS獲得的準分子離子峰精確相對分子質(zhì)量信息、同位素分布及MS/MS獲得的二級碎片信息并結合保留時間對其進行鑒別(表1)，結構見圖6。

圖5 霍山野生赤芝和栽培赤芝OPLS-DA差異成分分析結果散點圖

結果表明，霍山野生赤芝中有3個成分含量顯著高于栽培靈芝，分別為靈芝酸C2、靈芝酸D和靈芝酸A；栽培赤芝中有3個成分含量顯著高于野生靈芝，分別為赤芝酸A、赤芝酸E2和赤芝酸D。6個差異成分的化學結構見圖6。

4 討論

TOF-MS定性最重要的線索是高分辨率的分子離子峰，再結合同位素模式，即可推斷化合物的分子式；最后結合MS/MS的碎片信息、保留指數(shù)、紫外吸收和文獻檢索等多種方法，最終對推斷出的化合物做到定性鑒定[16]。但是僅依靠質(zhì)譜方法進行化合物定性有很大的局限性，其過于依賴代謝組數(shù)據(jù)采集的質(zhì)量。此外，對于同分異構體或者具有類似質(zhì)譜裂解行為的化合物，僅依靠質(zhì)譜數(shù)據(jù)很難區(qū)分。

在本研究中，通過TOF-MS獲得的準分子離子峰精確相對分子質(zhì)量信息、同位素分布及MS/MS獲得的二級碎片信息并結合保留時間對霍山野生和栽培赤芝的差異代謝物進行定性鑒定，結果發(fā)現(xiàn)霍山野生赤芝中有3個成分含量顯著高于栽培赤芝，分別為靈芝酸C2、靈芝酸D和靈芝酸A；栽培赤芝中有3個成分含量顯著高于野生赤芝，分別赤芝酸A、赤芝酸E2和赤芝酸D。為了確證霍山野生和栽培赤芝的差異代謝物結構，通過與相應對照品比對，最終確定差異代謝物的結構和類別。本研究結果不僅為霍山栽培品赤芝和野生赤芝的物質(zhì)基礎研究提供了重要的依據(jù)，也為進一步研究赤芝提供了參考。

表1 霍山野生赤芝和栽培赤芝差異代謝物

圖6 霍山野生赤芝和栽培赤芝差異的三萜酸成分結構式