利用BSA-Seq 方法鑒定谷豐B 抗稻瘟病基因

陳子強，陳松彪，郭新睿，顏靜宛，田大剛，李 剛，王 鋒

（1. 福建省農業遺傳工程重點實驗室/福建省農業科學院生物技術研究所，福建 福州 350003；2. 閩江學院海洋研究所海洋與農業生物技術實驗室，福建 福州 350108）

0 引言

【研究意義】稻瘟病是水稻最主要病害之一，每年可造成水稻10%～30%減產，嚴重年份部分稻區甚至出現絕收[1?2]。因此，稻瘟病防治一直是水稻生產和育種的重中之重。長期實踐證明，培育和種植抗病水稻品種是防治稻瘟病最經濟、安全和有效的措施，而發掘和鑒定稻瘟病抗性基因對于開展水稻抗病育種具有重要意義。【前人研究進展】截至目前，全世界已鑒定了100 多個稻瘟病抗性基因，至少24 個基因被克隆，包括Pib、Pi-ta、Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm、Pid2、Pi37、Pi36、Pik-m、Pi5、Pit、Pid3、Pid3-A4、Pi54、Pish、Pik-p、Pia、Pik、Pi-CO39、Pi25、Pi1、pi21 和Pb1 等[3?4]，促進了水稻抗稻瘟病分子育種的發展。然而，一方面抗性基因表現出對稻瘟菌生理小種高度專化性，另一方面由于稻瘟菌生理小種存在易變性，抗性基因在利用數年后抗性容易喪失，因此尋找和鑒定更多新的抗性基因一直被植物病理工作者和水稻育種家重視。近年來，興起一種快速簡單的性狀定位的方法——混合群體分離分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA），其基于臨時（如F1、F2 分離群體）或永久群體（如重組自交系、近等基因系）表現出明顯差異的個體，通過構建DNA 混池進行基因定位。BSA 已被應用于水稻質量性狀基因[5]和數量性狀基因（QTL）[6?7]的定位。【本研究切入點】谷豐B 是福建省農業科學院水稻研究所選育的具有廣譜、持久抗稻瘟病的優良品種，種植20 多年仍表現出穩定抗性[8]。該材料為挖掘廣譜持久抗性基因及研究抗性分子機制帶來了契機。【擬解決的關鍵問題】本研究以谷豐B 和日本晴分別作為稻瘟病抗病和感病親本，配制F2 代遺傳群體，接種稻瘟菌并鑒定表型。依據水稻稻瘟病抗性評價分級標準，選出極端材料構建感、抗池。通過BSA 測序分析，初步確定谷豐B 抗性基因連鎖區間。本研究旨在為谷豐B 抗性基因精細定位及基因克隆奠定基礎，并為分子標記輔助選擇提供標記資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料谷豐B、福恢838、甬優1 號、圭630、福恢718、IR0462 和日本晴均由福建省農業科學院生物技術研究所提供。以抗病品種谷豐B 為母本和感病品種日本晴為父本，雜交獲得F1 和F2 遺傳群體。

稻瘟菌株501-3、KJ201、IR16-1、RB22、RB6、2Y838-1 和CHNOS 由福建省農業科學院生物技術研究所保存。

1.2 稻瘟病接種鑒定

稻瘟菌接種在燕麥（或米糠）培養基中，25 ℃暗培養5～7 d，隨后刮掉表面菌絲并轉移至25 ℃光照條件下培養3 d 誘導孢子產生，供接種用。

接種試驗在福建省農業科學院生物技術研究所壽山實驗基地進行，接種方法參考Tian 等[3]的方法。水稻幼苗生長至3～4 葉齡時，進行人工噴霧接種。接種后接種池覆蓋遮光膜密閉24 h，揭開遮光膜后保證棚內相對濕度90%以上，溫度24～28 ℃，5～7 d 后調查發病情況。

按照國際水稻研究所發布的稻瘟病分級標準進行病級統計[9]，即：高抗——無病斑；抗——有針尖大小棕色斑點；中抗——有圓形至橢圓形灰色斑，褐色邊緣，直徑約1～2 mm；中感——有典型紡錘狀病斑，病斑面積小于葉面積的10%；感病——有典型紡錘狀病斑，病斑面積占葉面積的10.1%～50%；高感——有典型紡錘狀病斑，病斑面積大于葉面積的50%，甚至全葉枯死。

1.3 谷豐B 抗病性遺傳分析

谷豐B 和日本晴的F1 和F2 群體接種501-3 和IR16-1 菌株，并統計F2 群體抗病和感病植株分離比，采用χ2測驗進行分離比適合度檢測。

1.4 極端分離混合池重測序

谷豐B 與日本晴F2 群體接種501-3 菌株后，挑選極端抗病單株和極端感病單株各20 株，同時取親本谷豐B 和日本晴各10 株，采用CTAB 方法提取基因組DNA。分別將各自單株DNA 等量混合，利用二代測序技術對2 個混合池和兩親本進行20×和10×覆蓋度的全基因組測序，測序和數據處理由諾禾致源公司（中國）完成。

參考Liang 等[10]的方法計算2 個分離池的SNP頻率（SNP-index），隨后對2 個子代SNP-index 作差（△SNP-index）。對△SNP-index 在各個染色體上的分布進行作圖，選取95%置信水平作為篩選的閾值，確定連鎖區間。

2 結果與分析

2.1 谷豐B 抗病性鑒定

利用7 個稻瘟菌株501-3、KJ201、IR16-1、RB22、RB6、2Y838-1 和CHNOS 對谷豐B、福恢838、甬優1 號、圭630、福恢718、IR0462 及日本晴等材料進行人工接種。圖1 和表1 結果顯示，谷豐B 對7 個供試菌株均表現高抗性，福恢838、甬優1 號、圭630、福恢718 和IR0462 水稻材料對501-3、IR16-1、RB6 和2Y838-1 菌株表現出不同程度的感病。上述結果初步表明，谷豐B 基因組中可能攜帶了廣譜高抗稻瘟病基因。

圖 1 不同水稻品種接種501-3 菌株表型鑒定Fig. 1 Phenotypic identification on rice varieties inoculated with 501-3 blast strain

表 1 水稻品種稻瘟病抗性鑒定Table 1 Blast resistance of rice cultivars

2.2 谷豐B 對稻瘟菌501-3 和IR16-1 的遺傳分析

利用501-3 和IR16-1 菌株對谷豐B 和日本晴的F1和F2 群體進行接種，分析谷豐B 的抗性遺傳模式。結果顯示，F1 群體對501-3 和IR16-1 菌株均表現高抗，F2 植株出現不同程度抗病和感病。將抗病（包括中抗、抗和高抗）和感病（包括中感、感病和高感）植株的分離比按3:1 理論比例進行卡方測驗，其對應501-3 和IR16-1 的χ2值分別為33.09 和27.98，均顯著大于χ（0.05）2=3.84（表2），推測谷豐B 基因組存在多個位點影響稻瘟病抗性。

表 2 谷豐B 稻瘟病抗性遺傳分析Table 2 Genetic analysis on blast resistance of Gufeng B

2.3 BSA 測序和數據分析

基于上述結果，采用BSA 方法對20 個高感單株和20 個高抗單株構建的DNA 混合池以及親本進行全基因組測序，共產生 32.66 G 原始數據（Raw data）。過濾后獲得32.475 G 有效數據（Clean data），各樣本的Clean data 在9.880～12.177 G，所有樣品Q30≥91.52%，GC 含量在44.3%～47.59%；通過與日本晴參考基因組比對，各樣品比對率均在95.36%以上，4×覆蓋度（至少有4 個堿基的覆蓋）在87.48%～97.69%（表3）。由此可知，各樣本數據量足夠，測序質量高，測序數據比對結果正常，可用于后續的變異檢測及相關分析。

表 3 過濾后的數據統計表Table 3 Statistics on data after screening

將親本谷豐B 和日本晴測序結果比較，共篩選1 756 964 個SNPs 和409 345 個InDels 位點，數量足以覆蓋到整個基因組；各染色體SNP 和InDel 分布密度分別在4.037～5.902 個·kb?1和0.967～1.300 個·kb?1（表4）。這些多態性位點可被進一步用于基因的定位及關聯分析。

表 4 SNPs 和InDels 在水稻12 條染色體的分布Table 4 Distribution of identified SNPs and InDelsk in 12 chromosomes of rice

2.4 BSA-Seq 鑒定谷豐B 抗性基因連鎖區間

利用SNP 位點分析2 個混合池△SNP-index，以95%置信水平作為篩選的閾值進行全基因組掃描。結果（圖2）發現，位于第6 號和第11 號染色體的2 個區域出現了超過臨界值水平的峰，推測這2 個區域為稻瘟病抗性關聯區域。其對應日本晴基因組上的位置為Chr.6: 10 082-111 397 kb 和Chr.11: 120-266 kb，其中6 號染色體的關聯區域包含Pi2/9 抗病位點，而11 號染色體關聯區域為新的稻瘟病抗性遺傳位點。

圖 2 第6 號和第11 號染色體關聯區間部分區段所對應的物理位置Fig. 2 Locations of corresponding regions in Chromosome 6 and Chromosome 11

為了精細定位谷豐B 抗稻瘟病基因，從6 號染色體的關聯區間篩選出了4 006 個SNPs 和623 個InDels標記，從11 號染色體的關聯區間篩選出了752 個SNPs 和195 個InDels 標記。

3 討論與結論

抗譜寬、抗性強且持久的抗源是挖掘抗病基因資源，研究稻瘟病抗性分子遺傳機制的理想材料，如谷梅4 和子預44。Deng 等[11]從谷梅4 中鑒定了1 個廣譜持久抗瘟性新位點Pigm，并系統解析了Pigm持久抗病機制；子預44 是一個云南地方粳稻品種，截至目前已從該品種挖掘出抗不同稻瘟病菌株的主效基因Pi-zy（t）、Pi-zy3（t）、Pizy6（t）、Pizy4（t）和微效基因[12]。本研究人工接種鑒定結果表明，谷豐B 基因組中可能攜帶了廣譜高抗稻瘟病基因。通過抗性遺傳分析以及利用BSA-seq 方法，鑒定到2 個稻瘟病抗性關聯位點（分別為Chr.6: 10 082-11 397 kb 和Chr.11: 120-266 kb）決定了谷豐B 對501-3 菌株的抗性。其中，6 號染色體關聯區域可能和Pi2/9 基因座有關，而11 號染色體關聯區域可能是新的稻瘟病抗性遺傳位點。

Pi2/9 是公認對稻瘟病抗性育種有重要應用價值的位點，位于水稻第6 染色體短臂端。截至目前，已報道該基因座上至少有9 個稻瘟病抗性基因（Pi2、Piz、Piz-t、Pi9、Pi40、Pi50、Pi26、Pigm、Pi2-2），其中Pi2、Pi9、Pi50 以及Pigm 已被成功克隆[11,13?14]。張柱堅等[15]利用抗性基因標記鑒定谷豐B 可能存在Pigm、Pi-d2 和Pi-d3。結合本研究結果，表明谷豐B 對501-3 菌株的抗性是由Pigm 決定的。但有意思的是，研究發現單獨突變Pi-d2 或Pigm均能夠導致谷豐B 喪失對501-3 菌株抗性[15]，說明谷豐B 的稻瘟病抗性可能受多個位點共同影響。本研究發現一個新的關聯區域（Chr.11: 120-266 kb 區域）也可能對谷豐B 抵抗501-3 菌株侵染起關鍵作用，該區域包含25 個水稻基因（數據來源于NCBI 數據庫https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。深入研究將有助于明確廣譜高抗稻瘟病遺傳構成及其分子機制。

廣譜持久高抗的抗源常作為優良供體材料，應用于抗病分子育種。然而研究人員時常發現在選育過程中培育的新材料相比于原始供體親本，其抗譜變窄。這種現象的根本原因在于，我們對親本廣譜高抗稻瘟病遺傳構成及其內在機制缺乏了解，限制了分子標記輔助選擇準確、有效的應用。本研究結果可為后續合理利用谷豐B 抗病親本培育抗病品種提供有效信息。