山西省豬呼吸道疾病綜合征病原感染狀況調查

王 晨，孟玉凱，高 宇，岳偉東，張 甜，朱東陽，馬海利

（山西農業大學動物醫學學院，山西太谷030801）

目前，除非洲豬瘟等烈性傳染病外，影響養豬業健康發展的主要疾病有呼吸道疾病、消化道疾病和繁殖障礙性疾病，其中，以豬呼吸道疾病危害最為嚴重[1]。引起豬呼吸道疾病的因素很多，主要包括細菌、病毒、支原體等病原體和不良飼養管理因素等[2]。由豬肺炎支原體（MHP）與多殺性巴氏桿菌（PM）、豬鏈球菌（SS）、副豬嗜血桿菌（HP）或豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）等呼吸道致病菌混合感染引起的肺炎稱豬地方性肺炎（Swine enzootic pneumonia）[3]。由豬肺炎支原體（MHP）與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環病毒2 型（PCV2）、豬流感病毒（SIV）等呼吸道病毒混合感染引起的呼吸道疾病稱為豬呼吸道疾病綜合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）[3]。

PRDC 主要發生于6～10 周齡的保育豬和13～20 周齡的育肥豬，患病豬主要表現為體溫升高（40 ℃以上）、食欲降低、結膜炎、呼吸困難、咳嗽、喘氣等，發病率為25%～60%，病死率為20%～90%[4]。保育豬周齡越小死亡率越高，育肥豬死亡率低，但生長發育遲緩，飼料轉化率降低，給養豬業帶來了很大的經濟損失。我國的廣西、福建、黑龍江等省均報道了該病的發生[5-7]，目前山西省內PRDC 的感染狀況尚不明確。

為了調查山西省豬群中豬呼吸道疾病綜合征（PRDC） 的感染狀況，本研究利用PCR 技術對2019 年6—7 月采自山西省11 個市20 個規模化屠宰場的521 份豬肺組織樣品進行了PRDC 病原基因檢測，旨在為山西省防控PRDC 提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

521 份豬肺組織樣品于2019 年6—7 月采自山西省11 個市20 個規模化屠宰場，詢問、記錄生豬來源，并向當地動物疫控部門及相應的養殖場了解疫苗免疫接種情況。

1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒購自北京聚合美公司；RNA提取試劑盒購自天根生物科技公司；RNA 反轉錄試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司。

1.3 引物合成

檢測MHP、PRRSV、PCV2、PCV3、SIV 基因的特異性引物序列源自相關參考文獻，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所用引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 豬肺組織樣品的PCR 擴增

無菌操作取一小塊肺組織放入滅菌的研缽中，加入液氮進行研磨后，分別裝入2 個EP 管，利用試劑盒提取樣品總DNA 或RNA，并將提取的RNA經試劑盒反轉錄為cDNA。

利用不同病原體特異性引物并優化相應擴增條件[8-12]，對提取的521 份核酸樣品進行MHP、PRRSV、PCV2、PCV3、SIV 基因PCR 擴增，PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據PCR 擴增目的片段的有無、大小確定檢測結果。

2 結果與分析

2.1 豬肺組織樣品中不同病原體PCR 檢測結果

將豬肺組織樣品提取的DNA 分別利用MHP、PCV2、PCV3 特異的鑒定引物進行PCR 擴增，同時將肺組織樣品提取的RNA 反轉錄后分別利用PRRSV、SIV 特異鑒定引物進行擴增，部分樣品電泳結果如圖1、2 所示，利用針對不同病原體的鑒別引物可以擴增出MHP、PCV2、PCV3 預期目的片段，但未擴增出SIV。選取部分PCR 擴增產物膠回收后進行測序驗證，測序結果在NCBI 核酸數據庫中進行Blast 比對均為相應的病原體，因此，建立的PCR 鑒別方法可以用來區分不同病原體。

將山西省不同地區采集的521 份豬肺組織樣品分別利用針對豬呼吸系統綜合征不同病原體的鑒定引物進行檢測，結果發現，山西省不同地市采集的豬肺臟樣品中MHP 陽性率很高，為76.9%。另外，豬圓環病毒PCV2 及PCV3 的陽性率也較高，分別為61.6%和85.2%（表2）。經向相應地市動物疫控部門、豬養殖場管理人員進行了解調查，發現當地豬肺炎支原體（MHP）及豬圓環病毒（PCV2）的免疫接種率很低，很多農戶及大型養殖場均未曾免疫上述疫苗，因此，MHP 和PCV2 的陽性率較高。

表2 豬肺組織樣品PRDC 病原檢測結果

2.2 山西省不同地區PRDC 的病原檢測分析

山西省11 個市MHP 陽性率均在50%以上（表3），其中，陽泉市MHP 陽性率相對較低，為50%，各市單一MHP 感染陽性率均較低，多為混合感染，各市間無顯著差異，說明山西省各地MHP 感染較為嚴重，且以混合感染為主。由MHP 與病毒混合感染情況分析（表3）可知，大同市MHP＋PVC3 的陽性率較高，為43.4%，忻州市、長治市、運城市MHP＋PCV2＋PCV3 的陽性率均在56.4%以上，極顯著高于其他地市（P＜0.01）。MHP＋PCV2 ＋PCV3 ＋PRRSV 四重混合感染陽性率為6.1%，其中，晉城市陽性率較高，為30.2%，極顯著高于其他10 個地市（P＜0.01）。晝夜溫差變化、養殖環境等不良因素都容易誘發豬群的豬呼吸系統綜合征，不同市養殖場的飼養管理水平和疫苗接種率不同，是造成PRDC感染率差異的主要原因。

表3 各市豬肺組織PRDC 病原檢測結果

2.3 山西省不同模式養豬場PRDC 的病原檢測分析

20 個規模化屠宰場中，14 個屠宰場的生豬來源于規模化養豬場，6 個屠宰場的生豬來源于當地散養戶。由2 種養殖模式豬場PRDC 的病原檢測結果分析（表4）可知，2 種養殖模式下MHP 的陽性率均高于70%，但散養戶MHP 的陽性率為86.0%，高于規模化養豬場。

在豬肺炎支原體與病毒混合感染樣品中，散養戶MHP＋PCV2 的陽性率為8.9%，稍高于規模化養豬場；規模化養豬場MHP＋PCV3 的陽性率為26.3%，顯著高于散養戶；散養戶MHP＋PCV2＋PCV3及MHP＋PCV2＋PCV3＋PRRSV 的陽性率分別為48.6%、12.3%，均極顯著高于規模化養豬場。由此可知，散養戶由于養殖條件及生物安全防護不足等原因導致豬呼吸系統綜合征病原體的陽性率均高于規模化養豬場。

表4 不同養殖模式豬肺組織PRDC 病原檢測分析

3 結論與討論

本研究檢測的豬肺臟組織樣品采自山西省全省11 個市的20 個屠宰場，樣品來源涵蓋山西省所有地市。受非洲豬瘟期間生豬調運政策的限制，屠宰場生豬來源多為本地養豬場，即采集的樣品具有一定的代表性。

山西省11 個市均可檢出MHP 陽性樣品，此次樣品采集的20 個屠宰場的生豬來源中，80%以上的養殖場及養殖戶均未免疫豬肺炎支原體弱毒苗，即MHP 利用PCR 檢測陽性具有參考價值。山西全省樣品中MHP 的陽性率為76.9%，結果與李瑩瑩[13]、邱剛等[14]報道相符。各市MHP 感染率均在50%以上，根據生豬出欄時間推測，可能與春季整體上晝夜溫差變化較大，造成豬群抵抗力下降，更容易誘發呼吸道感染有關。401 份MHP 陽性樣品中389 份為混合感染，該結果提示MHP 是引起豬呼吸道疾病綜合征的重要誘發病原。單一MHP 感染主要引起豬的慢性肺炎，并不表現出明顯的癥狀；當MHP與PCV2、PRRSV、SIV 等混合感染時才會引起豬呼吸道疾病綜合征[15]。主要是由于MHP 進入呼吸道后，破壞宿主的黏膜纖毛屏障，引起呼吸道纖毛屏障系統功能減退，從而繼發其他病原的感染[16]。

山西省11 個市均檢出PCV2，陽性檢出率為61.6%，劉秀清等[17]對西寧市部分地區進行PCV2 流行病學調查，陽性率為49.94%，曹啟明等[18]對江蘇地區PCV2 進行流行病學調查發現，PCV2 陽性率為50%，表明我國的PCV2 感染仍然較為嚴重。此次檢出的321 份PCV2 陽性樣品中，269 份均為混合感染，這與PCV2 病毒可導致豬的淋巴系統功能衰竭和免疫抑制有關。因此，豬感染PCV2 后，容易繼發其他病原的感染。PCV2＋PCV3 混合感染有較高的檢出率，與李金鳳等[19]、ZHAO 等[20]研究結果一致，推測PCV2、PCV3 之間存在某種相互作用機制，促使病毒在體內增殖。

山西省11 個市PCV3 陽性檢出率為85.2%，原因可能是由于目前市場上尚無良好的PCV3 疫苗用于臨床預防，現有的PCV2 商品化疫苗對PCV3無交叉免疫保護作用，所以，PCV3 的陽性檢出率較高，且呈逐年上升的趨勢。截止目前，尚未分離培養出PCV3 病毒，現有研究僅證明PCV3 可能和豬皮炎與腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、繁殖障礙綜合征等病癥相關[21-22]，其作用機制、發病癥狀、產生的直接危害尚缺少數據支持。SIV 未檢出陽性樣品，這可能與采樣季節有關，豬流感易于冬春季節、天氣驟變等不良環境下多發。