QuEChERS結合UPLC-MS/MS方法檢測葉用甘薯中蘆丁等7種黃酮類物質

許亦峰

摘 要：利用QuEChERS結合UPLC-MS/MS建立葉用甘薯中黃酮類物質的提取檢測方法。以福菜薯18為材料，選定蘆丁等7種黃酮類物質，試驗確定流動相、質譜條件、凈化劑等條件，從而確定葉用甘薯中黃酮類物質的提取檢測方法。結果表明：以0.2 g C18作為凈化劑，流動相（A）0.1%甲酸水-（B）乙腈，蘆丁、異槲皮苷、二氫槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等7種黃酮類物質的碰撞能分別為-23/-40、44/27、23/32、27/42、-31/-29、25/24、-33/-31，7種黃酮類物質在5 min內完全分離，在0.05～1 μg·mL-1范圍內線性良好（R2>0.99），蘆丁、異槲皮苷、二氫槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等7種黃酮類物質回收率依次為96.52%～97.64%、97.26%～98.74%、92.95%～94.62%、96.23%～97.65%、90.23%～92.56%、99.12%～101.56%、83.65%～84.64%?；|效應分析中蘆丁、異槲皮素ME在100%～120%，表現為弱的基質增強效應，可以忽略;槲皮素、山奈酚ME在120%～150%，表現為中等基質增強效應;二氫槲皮素ME大于150%，表現為強基質增強效應;槲皮苷、柚皮素ME均小于50%，表現為強基質抑制效應。對福菜薯18中7種黃酮類物質檢測發現，福菜薯18中不含有二氫槲皮素，異槲皮素含量最高、其次為蘆丁。該方法專一性強、靈敏度高、重復性好，為葉用甘薯中黃酮類物質的提取檢測提供參考依據。

關鍵詞：QuEChERS法;液質聯用色譜儀;葉用甘薯;黃酮化合物

中圖分類號：S 531?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）11-0055-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.11.009

Determination of Seven Flavonoids in the Leaf-used Sweet Potatoes byMeans of QuEChERS Combined with UPLC-MS/MS

XU Yi-feng

（Ningde Inspection and Testing Center for Agricultural Product Quality andSafety， Ningde， Fujian 352100， China）

Abstract： The extraction and detection method of flavonoids in the leaf-used sweet potatoes was established by using the QuEChERS combined with UPLC MS/MS. By taking Fucaishu 18 as the material， and selecting the seven flavonoids including rutinum， isoquercitrin， taxifolin， quercitrin， quercetin， naringenin and kaempferol， the conditions such as the flow phase， mass spectrometry conditions， and purifying agent were determined in the experiment， so as to determine the extraction and detection method of flavonoids in the leaf-used sweet potatoes. The results showed that with 0.2 g C18 as the purifying agent and 0.1 % formic acid water （A）- acetonitrile （B） as the flow phase， the collision energies of rutinum， isoquercitrin， taxifolin， quercitrin， quercetin， naringenin and kaempferol were -23/-40， 44/27， 23/32， 27/42， -31/-29， 25/24 and -33/-31， respectively. The seven flavonoids were completely separated within 5 min with good linearity in the range of 0.05-1 μg·mL-1 （R2 > 0.99）. The recoveries of rutinum， isoquercitrin， taxifolin， quercitrin， quercetin， naringenin and kaempferol were 96.52%-97.64%， 97.26%-98.74%， 92.95%-94.62%， 96.23%-97.65%， 90.23%-92.56%， 99.12%-101.56%， and 83.65%-84.64%， respectively. In the matrix effect analysis， rutinum and isoquercitrin ME ranged from 100% to 120%， which showed the weak matrix enhancing effect and could be ignored. Quercetin and kaempferol ME ranged from 120% to 150%， showing the moderate matrix enhancing effect. Taxifolin ME was more than 150%， showing the strong matrix enhancing effect， while quercitrin and naringenin ME were both lower than 50%， showing the strong matrix inhibition effect. The seven flavonoids in Fucaishu 18 were detected， and it was found that Fucaishu 18 did not contain taxifolin， and the content of isoquercitrin in it was the highest， followed by rutinum. The method had strong specificity， high sensitivity and good reproducibility， which could provide reference for the extraction and detection of flavonoids in the leaf-used sweet potatoes.

Key words： QuEChERS method; Liquid chromatography-mass spectrometry; Leaf-used sweet potatoes; Flavonoids

葉用甘薯，俗稱地瓜葉、番薯葉，屬旋花科牽牛花屬草本匍匐性蔓生植物，是經人工選擇性培育出的專門供人們食用幼嫩莖葉的甘薯品種[1]。葉用甘薯營養豐富，與白菜、菠菜、韭菜、芹菜、茄子、胡蘿卜、番茄、甘藍等13種蔬菜相比，其所含的蛋白質、纖維素、胡蘿卜素、煙酸、脂肪、碳水化合物、鈣、磷、鐵等13項營養成分均居首位[2]。除此之外，葉用甘薯中還含有豐富的功能性成分-多酚類化合物，多酚類化合物是一種含有芳香環和一個以上羥基的物質，具有抗氧化、抗衰老、抗癌等生物活性[3]。Karna等[4]研究表明葉用甘薯中的多酚類物質含量豐富，其總酚含量是其他常見蔬菜的2～3倍。隨著人們健康意識的提高，葉用甘薯逐漸走進各家各戶的餐桌。在美國葉用甘薯被認為是最具有開發前景的保健蔬菜之一，日本將其列入“長壽食品”，法國稱其為“蔬菜皇后”[5]。

黃酮類物質是葉用甘薯中一種重要的多酚類化合物，具有強心，降血壓，促進細胞增生，減少糖醇堆積，有助于防止白內障等功效，是天然的食品抗氧化劑，很多研究學者[6-8]對葉用甘薯中黃酮類物質的提取和檢測進行了大量的研究。葉用甘薯中黃酮類物質的提取方法主要有溶劑提取、微波輔助提取、酶輔助提取、超聲波輔助提取等，但這些提取方法在凈化環節需要用到蒸餾、回流酸解等步驟，過程十分繁雜[9]。另外葉用甘薯中黃酮類物質的檢測方法通常使用高效液相色譜法、分光光度法、薄層色譜法等，這些檢測方法都有各自的不足之處，例如分光光度法只能檢測總黃酮的含量，無法對各種黃酮類物質進行分別定量;柱層析和薄層色譜法雖然能做到將各種黃酮類物質進行分離，但只能半定量，而且分析時間長、重復性差;高效液相色譜法能夠對葉用甘薯中各黃酮類物質進行分別定量，但相較于液質聯用色譜儀，其分析時間長，無法精準定性。

QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年來國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術[10]。當前主要用于農產品中農藥殘留的提取，未見QuEChERS方法應用在葉用甘薯中黃酮類物質的提取。本研究采用QuEChERS結合UPLCMS/MS方法，建立葉用甘薯中蘆丁等7種黃酮類物質的提取檢測方法，并對其回收率、精確度、基質效應等進行評價，以期為葉用甘薯中黃酮類物質的提取、檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 ?試驗材料

試驗材料選用品種為福菜薯18，由福建省農業科學院作物研究所提供[11]。

1.2 ?儀器與試劑

1.2.1 ?儀器 LCMS8050三重四級桿質譜儀（日本島津制作所），超聲波清洗儀KQ500E（昆山市超聲儀器有限公司），DirectQ 5超純水機（德國默克公司），318KS冷凍離心機（德國默克公司）。

1.2.2 ?試劑 凈化劑PSA（40～63 μm）、GCB（120～400目）、C18（40～63 μm）均購自上海安譜科技股份有限公司;黃酮類化合物：蘆丁、異槲皮苷、二氫槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚7種黃酮類物質標準品均購自上海安譜科技股份有限公司，純度均在99.99%以上;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜級，購于上海安譜科技股份有限公司。

1.2.3 ?標液溶液 儲備液：精確稱取各標準品5 mg，用5 mL甲醇定容，配制成1 mg·mL-1的單標儲備液。

7種黃酮類物質混標儲備液：從各黃酮類物質的單標儲備液中準確吸取100 μL于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至1 mL，配制成100 μg·mL-1儲備溶液。

溶劑標準工作液：精確吸取各單標儲備液10 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容10 mL，配制成1 μg·mL-1的混標中間儲備液，然后逐級稀釋成6個濃度梯度（0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg·mL-1），用于標準曲線的測定。

基質標準工作液：精確吸取各單標儲備液10 μL于10 mL容量瓶中，用基質液定容10 mL，配制成1 μg·mL-1的基質標中間儲備液，然后逐級稀釋成6個濃度梯度（0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg·mL-1），用于標準曲線的測定。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?樣品前處理 將田間獲得的樣品經干燥、粉碎、過篩（100目篩）制備成甘薯葉粉末。稱取0.2 g甘薯葉粉末，置于10 mL離心管中，加入10 mL甲醇+水（80+20），并充分漩渦振蕩。于60℃水浴超聲1 h后，5000 r·min-1，離心5 min。吸取2 mL上清液于10 mL離心管內，往管內加入0.2 g凈化劑，充分振蕩后，5000 r·min-1，離心3 min。吸取1 mL上清液過0.45 nm濾膜，待上機測定。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：C18（2.1 mm×100 mm）;流動相：（A）0.1%甲酸水和（B）乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，20%B;1～3 min，20%B～50%B;3～6 min，50%B～90%B;6～7 min，90%B;7～7.1 min，90%B～20%B;7.1～9 min，20%B。流速：0.3 mL·min-1;柱溫：40℃;進樣體積：5 μL;霧化氣流量：3 L·min-1;接口溫度：350℃。

1.3.3 質譜條件優化 用1.2.3的7種單標儲備液，各配制成0.1 μg·mL-1待測溶液，用全掃描（SCAN）正負離子模式逐一進樣，找到最佳母離子和相對應的離子模式。再對母離子進行不同電壓下的產物離子掃描，進而確定定性離子對、定量離子對以及碰撞電壓，從而建立最佳的多反應監測（MRM）方法。

1.3.4 流動相選擇 用1.2.3的7種混標儲備液，配制成0.1 μg·mL-1待測溶液，依次使用（A）水-（B）乙腈、（A）0.1%甲酸水-（B）乙腈、（A）水-（B）甲醇、（A）0.1%甲酸水-（B）甲醇4種不同的流動相，利用1.3.2方法考察4種流動相對蘆丁等7種黃酮物質的分離效果及信號響應的影響，選擇最佳流動相。

1.3.5 凈化劑選擇 用1.2.3中100 μg·mL-1的混標儲備液配制成1 μg·mL-1混標溶液，各吸取1 mL混標溶液于裝有0.2 g PSA、0.2 g C18、0.2 g GCB的10 mL離心管中，充分振蕩后，5000 r·min-1，離心3 min。吸取1 mL上清液過0.45 nm濾膜，上機測定，從而考察PSA、C18、GCB這3種凈化劑對7種黃酮化合物的吸附作用，從而選擇最佳的凈化劑。

1.3.6 檢測方法評估 精確吸取混合標準溶液，逐級稀釋成6個濃度梯度（0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg·mL-1），分別吸取5 μL進行測定。測定結果以峰面積（Y）對其濃度（X）進行線性回歸。選取添加水平為0.1 μg·mL-1的標準溶液，連續進樣6次，計算每種黃酮物質峰面積相對標準偏差RSD，用來評價方法的重現性。以信噪比S/N=3對應的濃度作為目標物的檢出限。

準確稱取9份0.2 g葉用甘薯樣品，分為3組，分別添加高（2.5 mg·kg-1）、中（0.5 mg·kg-1）、低（0.25 mg·kg-1）3個水平，參照1.3.1方法進行前處理，提取液經UPLC-MS/MS檢測，將檢測得到的峰面積代入標準曲線，從而得到相應的目標物含量，計算回收率?；厥章剩?）=A/B×100，其中A表示目標物質的檢測值;B表示目標物質的添加量。

1.3.7 基質效應分析 利用基質標準曲線測算出基質中目標物質本底濃度和峰面積，再用溶劑標準曲線測算出對應濃度下溶劑中目標物質的峰面積，利用公式計算基質效應。

基質效應強度ME（matrix effect ）（%）=A/B×100。其中A表示樣品中黃酮類物質的峰面積;B表示溶劑中同濃度黃酮類物質對應的峰面積。當ME>1時，表示基質增強效應，當ME<1時，表示基質抑制效應。若ME為80%～120%時，表示基質效應不明顯，可以忽略該基質效應;若ME在50%～80%或120%～150%時，表現為中等基質效應;若ME<50%或者ME>150%時，則表現為強基質效應[12-13]。

1.3.8 福菜薯18樣品檢測 稱取0.2 g福菜薯18待測樣品，按照1.3.1的方法進行前處理，1.3.2條件上機檢測，檢測福菜薯18中7種黃酮類物質的含量情況。2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

經過試驗，優化得到蘆丁、異槲皮苷、二氫槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等7類黃酮類物質的碰撞電壓分別為-23/-40、44/27、23/32、27/42、-31/-29、25/24、-33/-31，碎片離子分別為303.10/85.00、271.00/300.00、125.00/150、300.00/271.00、153.10/229.00、119.00/107.00、153.15/229.00，具體檢測條件見表1。利用優化后的質譜條件，7種黃酮化合物在5 min內完全分離，且峰型良好（圖1）。

2.2 流動相選擇

由圖2可知，（A）水-（B）甲醇、（A）0.1%甲酸水-（B）甲醇兩組流動相與另外兩組流動相相比，在相同時間內無法將蘆丁等7種黃酮類物質分離。（A）水-（B）乙腈、（A）0.1%甲酸水-（B）乙腈兩組流動相均可以將蘆丁等7種黃酮類物質分離開，但從圖2可知，（A）水-（B）乙腈組成的流動相檢測出的蘆丁、槲皮素、山奈酚3種黃酮類物質響應值過低，且異槲皮素、槲皮苷、山奈酚3種物質峰型存在拖尾現象，故選擇（A）0.1%甲酸水-（B）乙腈作為流動相。

2.3 凈化劑選擇

由圖3可知，PSA對蘆丁、異槲皮素、二氫槲皮素、槲皮苷、槲皮素、山奈酚的吸附作用強，回收率在6.7%～33.4%，對柚皮素的吸附作用較弱，回收率為78%;C18對蘆丁、異槲皮素等7種黃酮類物質的吸附作用都很弱，回收率在83.2%～100.4%;GCB對蘆丁、異槲皮素等7種黃酮類物質的吸附作用強，回收率在6.1%～33.6%。故選擇C18作為最佳的凈化劑。

確定C18作為凈化劑后，繼續考察C18的用量對凈化效果的影響。由表2可知，隨著C18用量的增加，蘆丁、異槲皮素等7種黃酮類物質回收率無明顯變化，但當C18用量達到0.3 g時，各黃酮類物質的回收率均呈現下降趨勢，各黃酮物質降幅在11.3%～16.4%。在回收率變化不大的情況下，盡可能的選擇用量大的凈化劑，以達到更好的凈化效果。故本試驗選擇C18的用量為0.2 g。

2.4 檢測方法評估

2.4.1 方法的分析特征量 試驗結果（表3）表明，7種黃酮類物質在0.05～1 μg·mL-1范圍內線性良好（R2>0.99），說明該方法的方法靈敏度良好。每種黃酮類物質峰面積的相對標準偏差RSD均小于5%，說明方法有良好的重現性和穩定性，能夠用于實際樣品中黃酮的分析。

2.4.2 回收率 通過計算（表4）可得蘆丁、異槲皮素、二氫槲皮素、槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚回收率分別在96.52%～97.64%、97.26%～98.74%、92.95%～94.62%、96.23%～97.65%、90.23%～92.56%、99.12%～101.56%、83.65%～84.64，RSD均小于5%，具有良好的穩定性。

2.4.3 基質效應 經試驗表明蘆丁、異槲皮素ME在100%～120%，表現為弱的基質增強效應，可以忽略;槲皮素、山奈酚ME在120%～150%，表現為中等基質增強效應;二氫槲皮素ME大于150%，表現為強基質增強效應;槲皮苷、柚皮素ME均小于50%，表現為強基質抑制效應。

2.5 福菜薯18中7種黃酮類物質的測定

經檢測發現，福菜薯18中未檢測到二氫槲皮素，表明福菜薯18中不含有該物質，其他6種黃酮物質均有檢測到，其中異槲皮素含量最高（26.34 mg·kg-1），蘆丁含量次之（5.35 mg·kg-1），槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚含量依次為0.011、0.60、0.032、0.18 mg·kg-1。

3 討論與結論

本試驗建立了QuEChERS結合UPLC-MS/MS提取檢測葉用甘薯中蘆丁等7種黃酮類物質的方法。QuEChERS在農殘檢測中較常使用，未見在黃酮類物質提取中使用。本次試驗發現凈化劑PSA、GCB對黃酮類物質的吸附作用很強，而C18吸附作用較弱，這是因為黃酮類物質多為平面結構，研究表明PSA、GCB對于平面結構的化合物具有強吸附作用[14-15]。此方法利用UPLC-MS/MS對黃酮類物質進行檢測，線性檢測范圍最低達到0.005 μg·mL-1，低于文獻中線性檢測范圍最低點[16-17]，而且5 min內7種黃酮類物質可以完全分離，大大提高了檢測的準確性和時效性。在后續的試驗中，可以嘗試在檢測方法中加入更多的黃酮類物質，使得葉用甘薯中黃酮類物質的檢測更加全面，為葉用甘薯中黃酮類物質的檢測提供依據。

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（責任編輯：柯文輝）