弧菌對養殖大菱鲆的危害及其防治方法研究新進展

黃華 陳坤 于文松 高雁 王亮 王曉飛 王鶴

(煙臺市海洋經濟研究院，山東煙臺 264006)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)又名多寶魚，原產于歐洲，于1992年引進我國[1]。大菱鲆具有生長速度快、耐低溫、飼料轉化率高、肉質鮮美可口等優點，因而逐漸成為我國沿海地區重要的海水養殖魚類。到2005年，我國大菱鲆工廠化養殖規模已躍居全球首位，養殖產量占世界大菱鲆養殖總量的87.5%，在進出口貿易中發揮著重要作用[1-2]。經歷了2006年的“多寶魚風波”后，在政府調控和各界努力下，次年大菱鲆產業規模得到恢復，逐漸進入平穩發展階段。但是，隨著工廠化養殖的發展，由于養殖規模和養殖密度的不斷增大、管理人員經驗不足、苗種質量低、地下海水水質多樣等問題，大菱鲆養殖早期出現的病害依舊較多，每年都會因病害導致較大的經濟損失。在已報道的大菱鲆寄生蟲病、細菌性疾病、病毒性疾病等各類疾病中，細菌性疾病發生的頻次最高，損失也較嚴重，其中尤以弧菌病發生頻次最高[3]。

大菱鲆弧菌病的病原弧菌屬(Vibrio)是一類革蘭氏陰性菌，普遍存在于河口、沿海海域的海水中以及海洋動物的體表和體內，在養成期大菱鲆的腸道微生物中所占比例最大[2]。弧菌屬的大部分種類是海洋環境或一些海洋動物中正常有益菌的組成部分，小部分能引發疾病。在我國近30年的大菱鲆養殖業發展中，對大菱鲆弧菌病的報道屢見不鮮。研究發現，能夠使大菱鲆致病的弧菌屬種類主要有鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[4-7]、哈維氏弧菌(V.harveyi)[8-9]、大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)[10]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[11]、鯊魚弧菌(V.carchariae)[12]、創傷弧菌(V.vulnificus)[13]、燦爛弧菌(V.splendidus)[14]、海利斯頓氏弧菌(V.pelagius)[5,15]、美人魚弧菌(V.damsela)[16]等。

我國弧菌病發病地區涵蓋了山東[6]、河北[5]、遼寧[13]等沿海大菱鲆養殖地區。患弧菌病的大菱鲆，其臨床表現各不相同，主要有體色變黑、鰓絲呈灰白色、腹部腫脹、鰭基部充血、口部充血發紅等。嚴重感染的病魚體表潰瘍、出血，解剖可見肝臟充血、脾腫大和腸道腫脹等癥狀[3]。

本文介紹幾種常見的弧菌病原對養殖大菱鲆的危害，并對近年來有關大菱鲆弧菌病新的檢測及防治方法進行總結，以期為該病的進一步研究提供參考。

1 常見弧菌病原對養殖大菱鲆的危害

1.1 鰻弧菌

鰻弧菌普遍存在于我國的大菱鲆養殖區，具有流傳面積廣、速度快等特點，能通過鰭、鰓、皮膚、腸道等多種途徑感染大菱鲆，引發腹水病、出血癥、爛鰭病等[4,17]。病魚通常會表現出食欲減退，體表變色、浮腫、潰瘍出血，腹部膨大有腹水，胸鰭、側鰭和尾鰭先發白后潰爛，鰭基部有紅斑，解剖可見內臟充血、脾腫大等癥狀[17]。患爛鰭病的大菱鲆，從鰭發白到死亡僅僅需要幾天時間。幼苗期及各個養成時期的大菱鲆都可能患爛鰭病[4]。

溶血素具有溶血性、細胞毒性和動物致死性等特性[18]。在鰻弧菌的毒力研究中發現，VAH1、VAH2、VAH3、VAH4、VAH5等胞外溶血素[19]及RTX系列蛋白是鰻弧菌的主要毒力因子，在侵染宿主的過程中起到穿孔作用[20]。鰻弧菌有10個O抗原型，其中O1型、O2型和個別O3型與水產動物弧菌病有關，最常報道造成大規模死亡的是O1型和O2型抗原型[21]。

1.2 哈維氏弧菌

哈維氏弧菌是海水養殖魚類的常見致病菌，通過鰓、口、體表等途徑感染養殖動物[22]。Iddya等[23]報道，哈維氏弧菌能在不同非生物基質表面上形成生物被膜。該菌能引發養殖大菱鲆患潰瘍癥、腹水病等。人類誤食含有哈維氏弧菌的水或食物后易罹患腹瀉、敗血癥、中耳炎等疾病[24]。

感染哈維氏弧菌后患潰瘍癥的養殖大菱鲆會出現體表病灶部位出血、肌肉潰爛、眼球凸出等典型癥狀。臨床初期表現為病魚不攝食，緩慢浮游于養殖池的邊緣，鰓絲潰爛、黏鰓，體表的病灶部位稍有發白，部分病灶部位充血發紅。中后期病魚的頭部、鰓蓋邊緣、上下體側的鰭基部潰爛，形成潰瘍面或深洞。解剖可見鰓絲貧血，膽囊、腎臟腫大，肝臟充血，腸壁充血并呈透明狀，腸內有淡黃色液體。養殖大菱鲆一般在發病1周左右死亡[8]。

1.3 大菱鲆弧菌

大菱鲆弧菌是大菱鲆腸道中的優勢菌[25]，屬于條件致病菌[26]。當大菱鲆受環境脅迫、患消化道疾病或被其他病原菌感染后，大菱鲆弧菌可轉為致病菌[27]，引發大菱鲆腹水癥[10]、腸炎病[27]等。感染大菱鲆弧菌后患腸炎的大菱鲆，解剖可見其腸壁明顯充血，呈紅色，腸道中有大量黏液和黃白色糞便。大菱鲆弧菌分高毒株和低毒株，菌株之間毒性差異較大[28]。對大菱鲆弧菌毒力因子的研究表明，該菌的胞外產物有堿性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶等多種活性蛋白酶[28]。大菱鲆弧菌的致病能力與胞外產物、黏附因子、脂多糖及某些外膜蛋白等有關。

1.4 溶藻弧菌

溶藻弧菌又名溶藻膠弧菌，屬革蘭氏陰性短桿菌，是我國近海海水養殖中常見的病原菌[29]，也是人獸共患的病原菌[30]。溶藻弧菌能引起大菱鲆苗種[31-33]和成魚[11]患腹水病，患病的大菱鲆腹部出血膨大，擠壓有液體流出，解剖可見淡黃色液體等。姜燕等[27]從患腸炎病的大菱鲆中分離出了溶藻弧菌。對弧菌毒力的研究表明，AcfA是弧菌重要毒力蛋白之一，能有效促進致病菌與宿主的黏膜黏附。陳妍妍[34]通過對溶藻弧菌acfA基因缺失株的研究，證實溶藻弧菌的acfA參與調控該菌鞭毛組裝、能量代謝等相關基因的表達，對sodB、flgG和dctQ具有正調控作用。

1.5 創傷弧菌

創傷弧菌普遍存在于河口、海水等環境中，是人類和養殖水產動物重要的病原菌之一，可引發原發性敗血癥，是目前發現的弧菌中致死率最高的致病菌，被稱為“海洋中的無聲殺手”[35-36]。創傷弧菌可引起人類的胃腸道疾病，嚴重者可引發敗血癥，50%以上患者因臟器功能衰竭而死亡[36]。沿海的國家基本上都對該菌有研究。據報道，美國因食用海鮮死亡的病例中，95%以上是由創傷弧菌引起的[37]。我國的江浙、閩粵沿海及臺灣地區也有較多的感染情況發生[38-39]。創傷弧菌能引起大菱鲆患出血性敗血癥、腹水癥[13]。感染早期，病魚的出血現象不嚴重，不容易被發現，后期病魚體表出現彌漫性出血點，毛細血管擴張充盈，并伴有腹水，解剖可見腸壁有出血點[13]。

目前對該菌致病因子的研究已達到全基因組層面，已有關于pldA、vgrG、aroQ、glpA等11個與創傷弧菌致病性相關的毒力基因的報道[40]，如pldA基因編碼磷脂酶A1是創傷弧菌溶血和致死的主要因子，vgrG基因能編碼六型分泌系統(type VI secretion system，T6SS)蛋白，通過肌動蛋白交聯域(actin cross-linking domains)發揮作用，影響創傷弧菌毒力。其中張嘉鑫等[40]于2020年報道新發現了aroQ和glpA基因編碼代謝蛋白，gspE、tolQ、flgJ、flgH和fliF基因編碼結構蛋白，VVCECT4999-03045和tpbB基因編碼信息傳遞蛋白。

1.6 燦爛弧菌

燦爛弧菌能感染多種水產養殖動物，如海參、貝類及魚類等。國內外學者研究發現，燦爛弧菌能感染大菱鲆幼魚，并導致幼魚的高死亡率。黑瘦癥是影響大菱鲆育苗成活率的重要因素之一。王印庚等[41]從患黑瘦癥的養殖大菱鲆幼苗中分離到了燦爛弧菌，病魚體色發黑，魚體瘦弱，頭大軀體小，呈蝌蚪狀畸形，發育遲緩，變態率低，基本不攝食。該病發病快，死亡率高。解剖后進行組織病理分析，可見病魚內臟組織器官萎縮、潰爛，肝組織萎縮變性，腦組織神經元細胞核溶解[41]。研究發現，燦爛弧菌是1種具有強黏附力的致病菌[42]，VsA蛋白與燦爛弧菌的生長、抗氧化有關，VsA基因是1種黏附因子，在黏附宿主細胞的過程中發揮作用[43]。

2 病原鑒定方法

快速診斷是疾病防治的重要手段，檢測弧菌病有傳統微生物學、分子生物學和免疫學等方面的方法。解剖患病的魚，從組織分離純化優勢菌進行生理生化試驗，通過《伯杰細菌鑒定手冊》進行鑒定是比較傳統的方法。在細菌鑒定中還常用16S rDNA序列分析、構建系統發育樹的方法。近年來對于大菱鲆弧菌病原鑒定的檢測技術又有多項突破。

創傷弧菌也是人類疾病的病原菌。關于該菌的研究較多，目前用于檢驗該菌的技術除常規分離鑒定法外，還有脂肪酸氣相色譜分析法[44]、膠體金免疫層析法[45]、分子生物學法(如常規PCR[46]、多重PCR[47]、熒光定量PCR[48])和變性高效液相色譜技術[49]等。近幾年，一些學者研究出了新的檢測技術，為大菱鲆弧菌病的檢驗提供了更加高效快速的手段。如Yin等[50]建立了多重降落PCR方法，該方法對創傷弧菌的檢測靈敏度為104CFU/mL，對溶藻弧菌和副溶血弧菌的檢測靈敏度為103CFU/mL。凌莉等[51]基于gryB基因保守序列建立了重組酶聚合酶擴增技術(RPA)檢測創傷弧菌，其反應條件為：在37 ℃下恒溫反應40 min即可，不需要特殊的儀器設備，靈敏度可達0.1 ng/μL，與PCR相當。張晶等[52]針對創傷弧菌vvhA基因序列保守區域設計了交叉引物恒溫擴增技術，對創傷弧菌的檢測靈敏度達1.28×103CFU/mL，檢測時長為40～60 min。李偉等[53]以β-actin基因為內標基因、創傷弧菌gryB基因為目標基因建立的重組酶聚合酶擴增技術(RPA-IAC)，在37 ℃下恒溫40 min即可出結果，檢測靈敏度達0.1 ng/μL。

基于gyrB基因的SYBR Green I實時定量PCR可用于燦爛弧菌的檢測，最低可檢測到20個拷貝gyrB基因，而同等條件下普通PCR擴增反應中最低可檢測出104個拷貝的燦爛弧菌gyrB基因[54]。另外，成翔宇等[55]通過對3個基因設計特異性引物建立的針對溶藻弧菌、副溶血弧菌和創傷弧菌的多重PCR檢測方法，靈敏度為102～103CFU/mL。繩秀珍等[56]構建了鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌等6種魚類病原性弧菌的血清學診斷抗原芯片，為大菱鲆弧菌病的血清學診斷奠定了基礎。

養殖動物患弧菌病的水體弧菌臨界濃度為104個/mL[57]。因此，上述方法均可用于養殖生產中病原弧菌的檢測。

3 養殖大菱鲆弧菌病的防治

3.1 預防方法

對于大菱鲆弧菌病的預防，除了提高養殖管理水平、加強營養控制、保持良好水質等生態防御手段外，還可以采取免疫預防的方法，如有針對性地投放免疫增強劑來提高大菱鲆對病害的抵抗能力。細菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)能針對特異性抗原起到保護作用，可以充當免疫促進劑。張偉等[58]的研究表明，溶藻弧菌脂多糖對大菱鲆的相對免疫保護率(RPS)可達75%。

為提高大菱鲆對弧菌病的免疫力，一些學者進行了大菱鲆幾種常見弧菌病疫苗方面的研究，結果表明，采用弧菌疫苗來預防大菱鲆弧菌病具有很好的效果[59-67]。其中，曹宏梅等[61]用福爾馬林滅活鰻弧菌和溶藻弧菌制備了2種單疫苗及二聯疫苗，通過腹腔注射免疫大菱鲆后，二聯疫苗對鰻弧菌和溶藻弧菌的RPS分別為83.52%和83.24%，鰻弧菌單苗對鰻弧菌攻毒的RPS為80.37%，溶藻弧菌單苗對溶藻弧菌攻毒的RPS為74.89%。張振國等[62]通過“擠出—滾圓”法制備了魚用三聯疫苗，經大菱鲆口服后，對溶藻弧菌和副溶血弧菌的RPS均超過50%。

丁山[63]制備的鰻弧菌三價滅活疫苗和鰻弧菌O1血清型滅活疫苗，經腹腔注射大菱鲆后28 d，RPS達到100%。鰻弧菌O1、O2、O3血清型滅活疫苗的免疫保護期達150 d以上，RPS最高達100%[64-66]。

另外，有學者研究發現，哈維氏弧菌TrxR蛋白具有較好的免疫原性，大菱鲆經其免疫后，對哈維氏弧菌的RPS為75%，表明其可作為亞單位疫苗用于該菌的免疫預防[67]。

3.2 治療方法

研究發現，在大菱鲆弧菌病的治療方面，一些西藥、中藥及生物抑菌劑等對大菱鲆弧菌病原具有很好的抑制效果。藥敏試驗顯示，從山東省某地的大菱鲆中分離的弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環素最為敏感，由弧菌引起的腸炎病可采用硫酸新霉素對癥治療[68]，用氟苯尼考防治大菱鲆弧菌病也是可行的[69]。一些學者通過研究中草藥體外抗菌效果證實，蘇木、五倍子、地錦草、石榴皮等4種中草藥對鰻弧菌等4種病原弧菌的抑制和殺滅作用明顯，最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)為1.56～3.12 mg/mL，最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)為3.12～6.25 mg/mL[70]；白頭翁、五倍子、石榴皮等3種中草藥對鰻弧菌的MIC為3.125 mg/mL，MBC為6.25 mg/mL[71]；鰻弧菌對菌陳、黃岑、烏梅等中草藥高度敏感，五倍子對鰻弧菌的MIC為1.51 mg/mL，MBC為12.5 mg/mL[5]；五倍子和白頭翁對燦爛弧菌的MBC均為25 mg/mL，黃柏、穿心蓮對燦爛弧菌的MBC為50 mg/mL[41]。

有學者通過藥敏試驗證實，弧菌已對多種類抗生素產生了不同情況的耐藥性[69,72]。弧菌病的治療藥物可根據情況選用相關部門批準的水產養殖用藥，但需要注意部分藥物的休藥期問題。除此之外，用于替代抗生素的天然無公害生物抑菌劑的研究一直在進行，其中噬菌體療法在水產養殖中應用廣泛，具有無污染、不殘留、不導致耐藥等優點，可用于大菱鲆弧菌病的治療。目前溶藻弧菌噬菌體對大菱鲆弧菌病的治療能力得到了證實，應用噬菌體制劑試驗組大菱鲆的生存率為70%[73]。植物精油具有抗菌活性，肉桂醛對大菱鲆弧菌的MIC為0.25 μL/mL，百里香酚為0.5 μL/mL，富含芳香醛、芳香酚和檸檬醛等成分的植物精油能夠很好地抑制大菱鲆弧菌[74]。

4 結語

養殖大菱鲆弧菌病的多種病原菌，如哈維氏弧菌[24]、創傷弧菌[37]、溶藻弧菌[30]等不但能感染水產養殖動物，而且會對人類健康造成重大危害，是公眾飲食健康的重大威脅之一。我國海產品種類豐富多樣，每年都有因食用海產品而引起的急性胃腸炎、腹瀉、食物中毒等疾病的報道，因此研究水產動物弧菌病的檢測技術及防治方法具有重要意義。

傳統檢測方法結果準確，但是存在耗時長、操作繁瑣且檢測目標單一、效率低、靈敏度低等問題。另外，有些菌由于檢測基因相似度高，采用16S rDNA序列分析法無法將其鑒定到種。目前大部分可以在遺傳基因水平上檢測弧菌的技術要求高、價格昂貴，很難在基層推廣應用。因此，對適用于基層檢測、設備要求不高、操作技術簡單、檢測時間短、檢測靈敏度高的新型檢測技術的研究十分必要。

長期使用抗生素治療會使病原菌產生耐藥性，并帶來水產品藥物殘留等問題。2019年，國務院獸醫行政管理部門公告水生食品動物禁止使用的藥品及其他化合物，將79種藥物劃為禁用藥物，其中包括頭孢曲松、頭孢哌酮、洛美沙星、氧氟沙星等幾十種抗生素，這為今后水生動物病害防治帶來了新挑戰。因此，在大菱鲆弧菌病的防治中，從源頭上防病顯得尤為重要。養殖者可采用投喂免疫增強劑的方法來增強魚類的免疫力，通過接種上市疫苗進行防病。但目前針對弧菌病疫苗制劑免疫效果的評價大多來自實驗室，進入中試階段的較少，如何獲得生產批文并投入生產是關鍵。因此，養殖大菱鲆患病后，要及時準確地診斷病原，并選用已經批準使用的水產用獸藥進行對癥治療。