宮頸細(xì)胞蠟塊制作方法在宮頸病變篩查中的比較研究

蘇訥敏，易馳喆，黃靈泉，張雪梅

（柳州市工人醫(yī)院病理科，廣西 柳州 545005）

子宮頸癌（cervical cancer）是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是威脅亞洲婦女健康的第2 大惡性腫瘤[1]。宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查方法的出現(xiàn)，為宮頸癌癌前病變及早癌篩查提供了重要手段。然而，液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)易受主觀影響，部分患者可能因非典型鱗狀細(xì)胞（ASC-UC）被漏診或因過(guò)度診斷而被分流至不必要的活檢檢查[2，3]，對(duì)其身體及心理均造成一定影響。研究顯示[4]，利用宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制作成細(xì)胞蠟塊能夠有效收集細(xì)胞，對(duì)于液基細(xì)胞學(xué)可疑陽(yáng)性的病例進(jìn)一步進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，可以協(xié)助提高診斷的準(zhǔn)確性，為臨床進(jìn)一步分流患者提供可靠的依據(jù)[5-7]。傳統(tǒng)的瓊脂包埋法[8]是常用的細(xì)胞蠟塊制作方法，顧維娜等[9]在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，使細(xì)胞更加集中，通過(guò)放入溫箱使瓊脂凝固，取得了較好的制片效果（以下稱(chēng)瓊脂溫箱凝固包埋法），本研究在兩者的基礎(chǔ)上，優(yōu)化凝固條件，保持細(xì)胞集中平鋪，簡(jiǎn)化流程，旨在為后續(xù)的免疫組化及分子病理檢測(cè)提供可能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集柳州市工人醫(yī)院病理科2018 年1月～12 月經(jīng)宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）剩余細(xì)胞學(xué)標(biāo)本270例，其中經(jīng)組織活檢診斷為炎癥、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL），鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的病例分別為148例、35例、72例、15例。

1.2 方法 將檢測(cè)剩余的宮頸液基細(xì)胞樣本平均分為3 份，倒入對(duì)應(yīng)編號(hào)的離心管中，以2000 rpm 離心10 min 收集細(xì)胞，分別用傳統(tǒng)瓊脂包埋法、瓊脂溫箱凝固包埋法、瓊脂冷凍凝固包埋法進(jìn)行細(xì)胞蠟塊制備。3 種細(xì)胞蠟塊制備完成后均進(jìn)行常規(guī)切片，HE 染色，由2 位高年資病理醫(yī)師共同閱片診斷。

1.2.1 傳統(tǒng)瓊脂包埋法 用吸管吸取上清液棄掉；取60 ℃3%瓊脂1 滴滴入離心管中，搖動(dòng)使瓊脂與細(xì)胞充分混合，將離心管置于4 ℃冰箱20 min；待混合液呈凝膠狀后取出，用包埋紙包好，按常規(guī)石蠟包埋制作細(xì)胞蠟塊。

1.2.2 瓊脂溫箱凝固包埋法[9]用吸管吸去大部分上清液，余留高于沉渣1 cm 的液體，混勻細(xì)胞懸液；將一滴60 ℃3%的瓊脂滴在胃鏡包埋盒的小槽中，使瓊脂均勻鋪滿(mǎn)小槽內(nèi)，并置于60 ℃溫箱2 min；吸取全部細(xì)胞懸液于包埋盒的小槽，放置溫箱4 min；待細(xì)胞沉渣凸面變?yōu)榘济鏁r(shí)，在胃鏡包埋盒的小槽內(nèi)再次滴加瓊脂，直至覆蓋沉渣表面少許，再次將包埋盒放入溫箱2 min；包埋盒置于冰箱冷凍倉(cāng)冷凍3 min后，將瓊脂塊取出，用包埋紙包好，按照常規(guī)石蠟包埋制備細(xì)胞蠟塊。

1.2.3 瓊脂冷凍凝固包埋法 吸取1 滴滴入60 ℃3%的瓊脂滴在小號(hào)包埋盒中，使瓊脂均勻平鋪于包埋盒，置于冰箱冷凍倉(cāng)3 min，使瓊脂凝固；用吸管吸去離心管上清液，將細(xì)胞沉渣吸出盡可能平鋪于凝固的瓊脂中心后在包埋盒中再次滴加瓊脂至剛好覆蓋沉渣完全，包埋盒放入冰箱冷凍倉(cāng)3 min 后，將瓊脂塊取出，按照常規(guī)石蠟包埋制備細(xì)胞蠟塊。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 比較3 種方法制片效果、診斷陽(yáng)性率及診斷的符合率。細(xì)胞學(xué)：參照《子宮頸細(xì)胞學(xué)Bethesda 報(bào)告系統(tǒng)》（第2 版）標(biāo)準(zhǔn)。組織學(xué)：依據(jù)2014 年第4 版WHO 女性生殖器官腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分為：炎癥、低級(jí)別低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）及鱗狀細(xì)胞癌（SCC）。以活檢組織學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，以發(fā)現(xiàn)高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變及鱗狀細(xì)胞癌為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 軟件分析，計(jì)數(shù)資料使用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蠟塊及切片制作效果

2.1.1 肉眼觀察 利用傳統(tǒng)瓊脂包埋法制作的細(xì)胞蠟塊因細(xì)胞與瓊脂混雜，細(xì)胞較分散，肉眼觀組織輪廓不清晰，瓊脂溫箱凝固包埋法及瓊脂冷凍凝固包埋法所制的細(xì)胞蠟塊因細(xì)胞沉渣被瓊脂包裹于中心，細(xì)胞較集中，組織輪廓清晰，見(jiàn)圖1。

2.1.2 顯微鏡下觀察 傳統(tǒng)瓊脂包埋法細(xì)胞較分散，背景混雜瓊脂無(wú)定型物，每張切片能夠觀察到的細(xì)胞較少，另外兩種方法制成的切片細(xì)胞相對(duì)集中，觀察細(xì)胞數(shù)量較多，其中瓊脂冷凍凝固包埋法較瓊脂溫箱凝固包埋法細(xì)胞更加集中和平鋪，所觀察的細(xì)胞數(shù)也更多，見(jiàn)圖2。

圖1 三種細(xì)胞蠟塊制備方法蠟塊及切片肉眼觀

圖2 三種細(xì)胞蠟塊制備方法的HE 染色切片顯微鏡下形態(tài)

2.2 操作過(guò)程及用時(shí) 傳統(tǒng)瓊脂包埋法操作簡(jiǎn)單，但瓊脂及細(xì)胞混合物凝固時(shí)間較后2 種長(zhǎng)；瓊脂冷凍凝固法相對(duì)瓊脂溫箱凝固法操作步驟簡(jiǎn)單，用時(shí)較短。

2.3 篩查陽(yáng)性率及診斷符合率 3 種方法每組各270例標(biāo)本，細(xì)胞蠟塊制作均滿(mǎn)意，TCT 及3 種細(xì)胞蠟塊制備法診斷陽(yáng)性率分別為25.92%（70/270）、24.44%（66/270）、27.41%（74/270）、30.00%（81/270），3 種細(xì)胞蠟塊制備方法診斷陽(yáng)性率分別與TCT 結(jié)果相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3 種方法與其診斷符合率分別為86.67%（234/270）、92.59%（250/270）、95.93%（259/270），與后2 種細(xì)胞蠟塊制備法相比，傳統(tǒng)瓊脂包埋法診斷符合率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），瓊脂溫箱凝固包埋法與瓊脂冷凍凝固包埋法與組織病理診斷符合率較高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 TCT、三種細(xì)胞蠟塊制備法以及組織活檢結(jié)果（n）

3 討論

目前對(duì)于宮頸癌前病變的篩查最常用的方法是液基細(xì)胞學(xué)檢查，因其取材簡(jiǎn)單，操作方便，易于觀察被臨床廣泛使用[10]，然而對(duì)于部分可疑陽(yáng)性的病例，臨床處理過(guò)程中，部分患者被建議3～6 個(gè)月后復(fù)查，部分被分流至宮頸活檢及進(jìn)一步行免疫組化檢測(cè)協(xié)助診斷，極易漏診或過(guò)度處理[11]，同時(shí)對(duì)患者身心都造成一定影響，因此有必要探索一種既能在早期提高宮頸病變篩查的準(zhǔn)確率，又操作簡(jiǎn)單便捷的方法，如何充分有效利用細(xì)胞學(xué)標(biāo)本顯得尤為重要。液基細(xì)胞的保存有一定的時(shí)限性，且需要耗費(fèi)的資源及成本較高，研究顯示細(xì)胞蠟塊技術(shù)可彌補(bǔ)這一缺陷，并且有助于提高細(xì)胞病理學(xué)診斷的敏感性和特異性[12]。將TCT 剩余標(biāo)本制作成細(xì)胞蠟塊，能夠收集更多刷取的脫落細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)組織學(xué)重構(gòu)，便于反復(fù)、連續(xù)切片，并為進(jìn)一步免疫組化及分子檢測(cè)提供可能，為細(xì)胞學(xué)診斷提供更多依據(jù)，大提高了細(xì)胞學(xué)診斷及分流的時(shí)效性及可能性。

宮頸液基細(xì)胞不同于胸腹水具有纖維蛋白網(wǎng)羅細(xì)胞的功能，宮頸液基細(xì)胞標(biāo)本細(xì)胞含量較少且較為松散，制作細(xì)胞蠟塊時(shí)細(xì)胞沉渣的收集及取出比較困難。文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)瓊脂包埋法[8]是在離心管內(nèi)滴加瓊脂，將細(xì)胞沉渣及瓊脂混合后取出混合物。本研究發(fā)現(xiàn)在滴加瓊脂的過(guò)程中，細(xì)胞沉渣被瓊脂沖散，瓊脂與細(xì)胞混合物不易成形、細(xì)胞分散、不易成團(tuán)、切片時(shí)細(xì)胞難以處于同一平面，導(dǎo)致可觀察的細(xì)胞數(shù)較少，同時(shí)鏡下易出現(xiàn)瓊脂無(wú)定型物背景，影響觀察及診斷。顧維娜等[9]報(bào)道的瓊脂溫箱凝固包埋法相比傳統(tǒng)瓊脂包埋法，采用瓊脂上下包裹細(xì)胞，使細(xì)胞聚集在一定范圍內(nèi)，易于觀察切片。然而本研究發(fā)現(xiàn)采用溫箱蒸發(fā)凝固胃鏡包埋盒中平鋪的瓊脂時(shí)，由于水分的蒸發(fā)，瓊脂表面會(huì)凹凸不平，局部下陷，再將細(xì)胞放入瓊脂表面時(shí)，也將造成細(xì)胞分布層次不一，影響切片觀察，并且整個(gè)操作過(guò)程步驟較多，較費(fèi)時(shí)。

本研究在上述瓊脂溫箱凝固包埋法的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)改良，優(yōu)先快速冷凍凝固底層瓊脂使其產(chǎn)生一個(gè)平面，將細(xì)胞沉渣平鋪于瓊脂平面上，保證了細(xì)胞團(tuán)塊的集中和平整，有利于切片，可以減少蠟塊修整導(dǎo)致的細(xì)胞含量損失，后將表層瓊脂覆蓋并快速冷凍凝固，易于將瓊脂塊整體取出，切片后細(xì)胞量多，集中、平鋪，制片效果好，且操作過(guò)程簡(jiǎn)單省時(shí)，是一種較好的宮頸細(xì)胞蠟塊制備方法。

對(duì)細(xì)胞蠟塊診斷數(shù)據(jù)分析顯示：TCT 及3 種細(xì)胞蠟塊制備法診斷陽(yáng)性率分別為25.92%、24.44%、27.41%及30.00%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示細(xì)胞蠟塊對(duì)于宮頸病變篩查陽(yáng)性率與TCT 結(jié)果相仿，可以作為除TCT 外的選擇，并通過(guò)后續(xù)免疫組化及分子病理檢測(cè)進(jìn)一步對(duì)病變進(jìn)行分流，這一結(jié)論與朱勇等[12]的研究結(jié)果一致。此外，與后2 種細(xì)胞蠟塊制備法相比，傳統(tǒng)瓊脂包埋法與組織活檢診斷符合率較低，瓊脂溫箱凝固包埋法與瓊脂冷凍凝固包埋法與組織病理診斷符合率較高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示經(jīng)過(guò)改良后的2 種瓊脂凝固包埋法均較傳統(tǒng)瓊脂包埋法有助于提高診斷的準(zhǔn)確率，雖然2 種改良后的方法在診斷準(zhǔn)確率上無(wú)明顯差異，但瓊脂冷凍凝固包埋法在操作便捷及用時(shí)方面優(yōu)于瓊脂溫箱凝固包埋法。

綜上所述，可以考慮將宮頸液基細(xì)胞蠟塊制備技術(shù)作為T(mén)CT 替代方案，不僅可以提高早期宮頸病變篩查的準(zhǔn)確性，同時(shí)也為部分需要進(jìn)一步明確診斷的患者提供了檢測(cè)機(jī)會(huì)，如通過(guò)對(duì)細(xì)胞蠟塊P16及Ki-67 表達(dá)情況可以早期發(fā)現(xiàn)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變，避免不必要的創(chuàng)傷性活檢及漏診，為患者節(jié)約了檢測(cè)成本，減輕了患者身心負(fù)擔(dān)。瓊脂冷凍凝固包埋法是一種較好的宮頸細(xì)胞蠟塊制備方法。