石油降解菌篩選及應用研究

鄢雨朦

(遼寧大學 環境學院，遼寧 沈陽 110031)

1 引言

在石油生產運輸和使用過程中，由于操作不當或意外事故導致石油泄漏，會對環境造成嚴重污染。近年來受石油污染的土地面積不斷擴大，污染程度也日益嚴重。由于石油的主要成分有烷烴、苯、甲苯、二甲苯等多種復雜芳香烴，這些物質毒性大，有的有致癌致突變作用，進入土壤后難以去除，而且會隨著徑流進入周圍的流域、地下水、油田及周圍的生態環境中，帶來了嚴重的環境問題[1]。有害的石油污染物經食物鏈富集在人體內，還會對人體造成嚴重的損傷[2]。

石油造成的土壤污染通常采用物理和化學方法去除，前者通過焚燒而破壞大部分有機污染物，這種方法費用高，不利于處理；后者采用化學浸提，效果較好，但因易造成二次污染而受到限制[3]。為治理石油污染的土壤，石油降解菌的發現，為石油污染的治理提供了新思路新方法。石油污染的生物修復技術由于生產費用低、不產生二次污染而被視為一項具有廣闊前景的高新技術。

2 實驗材料

(1)石油無機鹽培養基：K2HPO46 g，KH2PO46 g，(NH4)2SO46 g，NaCl 5 g，石油1 g，pH值為7.0，蒸餾水1000 mL。固體培養基在此基礎上加入瓊脂15～20 g即可。

(2)牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH值為7. 0～7.2，121 ℃滅菌20 min。固體培養基在此基礎上加入瓊脂15～20 g即可。

3 菌株的篩選、鑒定及應用

3.1 菌株的篩選

在被石油污染的土壤環境中采集土樣，稱取土樣10 g，放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在室溫條件下，以180 r/min的速度震蕩20 h，震蕩后靜置。待出現固液明顯界面后，取土壤懸濁液用梯度稀釋法進行10-1、10-2、10-3梯度濃度稀釋[4]。分別取不同濃度梯度的上清液加入到含有石油的石油無機鹽培養基中進行富集，在37 ℃、120 r/min的恒溫振蕩器中培養7 d，循環3次。

采用平板劃線法進行分離，將在石油無機鹽培養基中富集后的菌株，分別用接種環蘸取少量液體在油平板培養基上依次劃線，在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h，能在石油平板上長出來的則是石油降解菌[5]，共得到6株菌，編號為1#～6#。

取各菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃、160 r/min恒溫振蕩器中培養24 h，按體積百分比5%的接種量接種到100 mL濃度為1 g/L的石油無機鹽培養基中，37 ℃、160 r/min恒溫振蕩器中培養5 d，設置空白對照。最終發現6株菌降解效果有明顯差異，其中肉眼觀察接種菌株2#的培養基中石油呈絮狀、不粘于瓶壁，一部分漂浮在培養基液體表面上，一部分存留培養基內使溶液懸濁，區別于接種其它株菌的培養基，故選用2#菌株進行后續實驗。

3.2 菌株的鑒定

3.2.1 菌株2#的形態與特征

對篩選出的菌種進行形態學觀察并進行生理生化實驗[6]。菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，淡黃色半透明。顯微鏡下觀察菌體為球狀，革蘭氏染色結果為陽性。菌株有排油效果，能分解葡萄糖產酸，具有過氧化氫酶性，對淀粉起水解作用。

3.2.2 16SrDNA測序

16SrDNA測序由生工生物(上海)股份有限公司完成，測序結果在Gen Bank上與已知種屬的16SrDNA進行BLAST，對獲得的同源序列進行分析并構建進化樹。系統進化樹如圖1所示，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[7]和《伯杰細菌鑒定手冊》[8]，對菌株2#進行16SrDNA測序，然后進行同源性比較，結果發現與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)的16SrDNA序列的同源性為99%。因此結合生理生化指標可得，菌株2#歸屬于陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。

圖1 菌株的進化樹

3.3 菌株降解石油的應用

稱取1 g石油溶于100 mL石油醚中，作為基準用油；分別稀釋至0.2、0.1、0.02、0.01、0.001、0.002 g/L，用紫外分光光度計測定其吸光度[9]，作出原油濃度—吸光度標準曲線，得到回歸方程為y=0.019x+0.0322。

按體積百分比，分別投加1%、3%、5%、7%、10%的陰溝腸桿菌到100 mL石油濃度為1 g/L的無機鹽培養基中，設置空白對照，在35 ℃、160 r/min恒溫振蕩器中培養5 d。肉眼可見接種菌株的培養基中的石油呈絮狀，一部分絮狀石油漂浮在培養基液體表面，還有一部分留在培養基內部使溶液呈懸濁狀態，與空白對照有明顯差別。以石油醚為參比液測定吸收值，將測得的吸收值在標準曲線上對照查得含油量，計算菌株2#的石油降解率。不同菌株接種量降解石油的效果也不同，結果如圖2所示。

圖2 菌株投加量與石油降解率關系

由圖2可見，實驗得到的菌株2#對石油具有明顯的降解作用，菌株投加量為1%(體積百分比)時降解效果最好，培養5 d后降解率可達到26.41%。

4 結語

從石油污染土壤中分離到一株石油降解菌2#，經16SrDNA測序鑒定為陰溝腸桿菌屬，該菌能將石油作為唯一碳源進行代謝活動。采用該菌降解石油，菌株投加量為1%時能夠達到最佳降解條件，將此菌株應用于石油污染的治理中，菌體在降解石油后，其菌體本身可通過自然降解而去除，不僅可用于處理被石油污染的環境，還不會對環境產生二次污染。這些結果為進一步采用該菌修復石油污染的土壤奠定了基礎。