豬瘟病毒感染過程中非結構蛋白作用的研究進展

楊志剛，湯德元，廖少山，張森，韓超逸，晏仁潭

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

CSFV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivurts)，其完整的病毒粒子呈球型，直徑為38～50 nm，核衣殼呈立體對稱的二十面體結構，直徑約為29 nm，病毒囊膜表面延伸出許多長為6～8 nm含糖蛋白的纖突結構。CSFV為單鏈正鏈RNA病毒，基因組約為12.3 kb，含有一個開放閱讀框編碼大約3 898個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白經病毒蛋白酶和宿主蛋白酶裂解為12種成熟蛋白，包括4種結構蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結構蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1]。相關研究證明，CSFV非結構蛋白在其感染致病過程中發揮重要調控作用，CSFV各主要蛋白協同促進了疾病的發展進程。因此，本文對CSFV感染過程中各非結構蛋白的相關調控作用機制進行了綜述。

1 Npro蛋白

Npro蛋白是 CSFV編碼的第一個蛋白，分子量大小約為23 kDa，由168個氨基酸殘基組成。Npro在抑制I型和III型干擾素、促進CSFV復制、提高病毒毒力以及抗細胞凋亡等方面發揮著重要的作用。

在逃避宿主先天免疫方面，Npro能抑制宿主中I型和III型干擾素的產生。有研究表明，Npro可以通過蛋白酶體途徑降解IRF3以及與IRF7相互作用，從而降低I型干擾素的產生，進而來逃避先天免疫[2]，并協同病毒復制，從而增強了CSFV的致病性[3]。隨后，Gottipati等[4]將IRF3和重組純化的CSFV Npro置于緩沖液中直接進行反應，發現Npro能夠直接結合IRF3單體和二聚體，并且不依賴其活性狀態。Cao等[5]研究發現Npro通過抑制IRF1表達及其核易位進而抑制III型干擾素的產生。

Npro與病毒毒力有關，且在抗細胞凋亡和促進CSFV生長方面發揮作用。Mayer等在2004年發現缺乏Npro的CSFV突變體在體外和體內都被減毒，證明Npro與CSFV的毒力有關。之后，Li等[6]表達位于細胞質中的IRF3-Npro融合蛋白的突變體vSM-IRF3，并發現由于Npro核定位的破壞，vSM-IRF3在體外和體內毒力明顯減弱，證明了上述觀點，同時還發現Npro的核定位對于細胞中的有效復制至關重要。Johns等[7]為了闡明Npro的功能機制，進行了酵母雙雜交篩選，其中鑒定了抗凋亡蛋白HAX-1，通過共沉淀試驗證實Npro-HAX-1相互作用，在共轉染的細胞以及用野生型CSFV感染的轉染細胞中觀察到HAX-1，而在Npro缺失的CSFV感染細胞中未觀察到HAX-1，結果證明Npro通過與HAX-1相互作用，在抑制RNA誘導的細胞凋亡中發揮重要作用。Li等[8]發現poly(C)結合蛋白1(PCBP1)為CSFV Npro的新型相互作用蛋白，敲除PCBP1抑制了CSFV生長，而PCBP1的過度表達促進了CSFV生長，此外，I型干擾素被PCBP1和Npro下調，結果表明PCBP1正向調節CSFV的生長。

2 p7蛋白

P7蛋白是一種病毒孔蛋白，分子量大小約為7 kDa，由64個氨基酸殘基構成。研究表明，P7蛋白在病毒復制、孔形成、病毒毒力、改變細胞膜通透性等方面起著重要作用。Gladue等[9]研究發現p7的同框刪除對病毒生長有害，這表明p7對于細胞培養中的病毒復制至關重要；相對于高毒力的CSFV Brescia株，p7突變病毒在豬中部分或完全減毒，表明p7在CSFV毒力中具有重要作用；模擬內質網脂質組成的模型膜中的結構功能分析證實，p7是一種成孔蛋白，并且成孔活性駐留在C端跨膜螺旋中。之后，Guo等[10]研究發現在大腸桿菌或哺乳動物細胞中表達p7，導致細胞膜的通透性增加，在早期主要定位在ER上，而后期轉移到細胞膜上，缺失分析表明41～63氨基酸對于其孔蛋白的活性是必需的，以及Largo等[11]發現p7可以在ER的雙層膜結構模仿物上形成離子通道，并且該通道可以通過分子量為427.33的ANTS分子，這都證明了上述p7是一種成孔蛋白這一觀點。Zhao等[12]研究表明單獨的P7蛋白及其前體 E2-P7 蛋白復合體在調節蛋白相互作用和促進CSFV增殖的過程中起到重要作用，而不會影響病毒復制，這對上述p7對細胞培養中的病毒復制至關重要這一觀點進行了進一步證明。

3 NS2蛋白

NS2 蛋白由457個氨基酸殘基構成, 具有蛋白酶活性，能將NS2-3蛋白復合體切割形成NS2和NS3 2個單體蛋白，還能夠調節細胞生長、細胞周期進程和細胞凋亡，為病毒復制提供有利的環境。研究發現，含有完整NS2-NS3基因的RNA復制子在轉染的細胞中持續存在并繼續復制，不會對細胞造成任何明顯的形態或功能損害，而缺少NS2基因的基因組則能夠更有效地復制并引起細胞病變作用，這些發現表明NS2盡管對于RNA復制不是必需的，但是在其中具有一定的調節功能。之后，Li等[13]突變了CSFV NS2 N末端的幾個代表性保守殘基，并研究了這些突變如何影響病毒RNA復制和感染性病毒的產生，結果表明在NS2的N端2個天冬氨酸NS2/D60A或NS2/D60K和NS2/D78K的突變消除了感染性病毒的產生，并且在100位(NS2/R100A)用精氨酸代替丙氨酸導致病毒滴度顯著降低，含有病毒基因組RNA分子的細胞的連續傳代產生了回復株NS2/A60D、NS2/K60D和NS2/K78D，感染性病毒得到恢復，這些結果揭示了CSFV NS2 N末端能調節病毒復制，證明了上述觀點。Tang等[14]建立了穩定的表達CSFV NS2的豬臍靜脈內皮細胞系(SUVEC)，并發現該蛋白定位于內質網(ER)，細胞分析顯示，由于S期細胞周期停滯，表達NS2的細胞系的復制被抑制20%～30%，NS2還誘導內質網應激和激活NF-κB，這些結果證明了NS2誘導S期阻滯來調節細胞生長和細胞周期進程，從而為病毒復制提供有利的細胞環境，又進一步發現NS2的表達誘導內質網應激和激活NF-κB之后，從而上調IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并抑制MG132誘導的細胞凋亡，數據表明CSFV NS2在炎癥反應和持續感染中起重要作用[15]。此外，Kang等[16]利用酵母雙雜交分析出MOAP1、DNAJA1、GOPC、FANCL、TMED4和CSDE1可以與NS2相互作用，這些蛋白質主要與凋亡、應激反應、氧化還原、代謝有關，但具體作用有待進一步研究。

4 NS3蛋白

NS3蛋白分子量大小約為80 kDa，由683個氨基酸殘基構成，具有核苷三磷酸酶活性、絲氨酸蛋白酶活性和核糖核酸解旋酶活性，它們是轉錄和翻譯所必需的。研究表明，NS3具有解旋酶活性，在CSFV基因組復制發揮重要作用，并且NS3蛋白酶結構域和NS5B能夠調節NS3的核苷三磷酸酶活性和解旋酶活性。此外，NS3與腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)相互作用，降解了TRAF6，通過NF-κB信號通路促進CSFV復制[17]；NS3與TRAF5相互作用促進了TRAF5的表達，而TRAF5的表達又激活p38 MAPK，從而促進了CSFV復制[18]。近期的研究還發現宿主細胞蛋白PSMB10通過泛素-蛋白酶體途徑降解NS3蛋白，從而抑制經典豬瘟病毒的生長，這可能為豬瘟的治療提供一定的思路[19]。

5 NS4A蛋白

NS4A蛋白分子量大小約為6 kDa，由64個氨基酸殘基組成，是NS2-3蛋白的輔助因子，在病毒的復制和病毒顆粒組裝中發揮重要作用。最近，Wang等[20]發現CSFV感染通過MAVS途徑誘導豬臍靜脈內皮細胞表達和分泌IL-8，還證明了NS4A定位于細胞核和細胞質，且通過增強MAVS途徑誘導IL-8的產生，并促進CSFV復制。

6 NS4B蛋白

NS4B蛋白分子量大小約為38 kDa，由347個氨基酸殘基組成，有2個保守的結構域，分別是WalkerA(209～216 aa)和WalkerB(335～342 aa)，具有NTPase活性，能與非結構蛋白(即NS3、NS4A、NS5A和NS5B)一起形成RNA復制復合物，在病毒復制、毒力、抗細胞凋亡等方面發揮重要作用。研究發現，WalkerA對NTPase活性至關重要。Tamura等[21]研究表明NS4B對病毒的毒力有影響，可以與E2通過協同作用提高病毒的致病性，之后又進一步發現NS4B N末端結構域介導的細胞內膜結合可以決定細胞培養中的CSFV基因組復制和豬的病毒致病性[22]。

研究發現，NS4B可以與多種蛋白相互作用并發揮作用。Lin等[23]證明Rab5與NS4B相互作用以促進NS4B相關復合物的形成并增強CSFV增殖；Qian等[24]發現鐵蛋白重鏈(FHC)(一種著名的抗凋亡蛋白)是一種與NS4B相互作用的蛋白，可增強CSFV復制，并通過調節調節細胞活性氧(ROS)來抵消細胞凋亡；研究人員[25]通過酵母雙雜交(Y2H)系統篩選、亞細胞共定位、共免疫沉淀和谷胱甘肽S-轉移酶下拉分析證明了坦克結合激酶1(TBK1)是NS4B相互作用的細胞蛋白，但具體作用有待進一步研究。最近，Zhang等[26]研究發現豬RING指蛋白114(pRNF114)(一種RING域E3泛素連接酶)是潛在的抗CSFV因子，pRNF114通過靶向并催化NS4B蛋白的K27連接的多聚泛素化，然后促進蛋白酶體依賴性的NS4B降解，從而抑制CSFV的復制，這為開發豬瘟的治療方法提供新的思路。

7 NS5A蛋白

NS5A蛋白分子量大小約為55 kDa，由496個氨基酸殘基組成，是一種磷酸化的多功能蛋白，能抑制NF-κB信號通路和誘導宿主細胞的自噬，在調節病毒復制方面發揮重要作用。研究發現，NS5A蛋白定位于內質網，通過N和C端結構域刺激病毒復制和抑制病毒翻譯。之后，Chen等[27]研究發現NS5A可以通過與NS5B和3'UTR結合而調節病毒的復制，當無法與NS5B結合時，NS5A仍可以通過與3'UTR結合來調節病毒的合成，同時，Sheng等[28]發現當細胞中NS5A的水平較低時，NS5A與NS5B一起結合3′UTRSL-1，促進病毒復制；而當NS5A水平較高時，NS5A蛋白除了結合3′UTRSL-1之外，還結合3′UTRSL-2，正是NS5A與3′UTRSL-2的結合可能抑制了NS5B以相同的3′UTR為模板的病毒合成，這對上述觀點進行了進一步解釋。此外，Xie等[29]研究表明NS5A可以切割形成兩科個截斷形式的b和c，通過蛋白酶抑制劑和shRNA干擾的實驗表明，caspase6蛋白酶介導形式c的切割，另一種未知蛋白酶介導形式b的切割，下調或抑制該蛋白酶的活性顯著的降低了基因組復制和病毒產生，證明NS5A的切割有利于病毒的復制。

研究表明，NS5A通過誘導宿主細胞的自噬和抑制NF-κB信號通路，從而促進病毒的復制和成熟。Pei等[30]研究發現CSFV通過誘導宿主細胞的自噬途徑從而促進病毒的復制和成熟，免疫電子顯微鏡檢查進一步證實了E2和NS5A蛋白與自噬小體樣囊泡的共定位，所以NS5A可能對CSFV誘導自噬具有重要意義，但其機制尚待闡明。Dong等[31]發現在豬肺泡巨噬細胞中，CSFV NS5A通過抑制NF-κB信號通路抑制poly(I：C)誘導的炎癥細胞因子分泌，這可能有助于尋找新的方法來預防CSFV感染。

NS5A能與宿主細胞中多種蛋白發生相互作用，從而增強病毒復制，同時也發現一些蛋白能與NS5A相互作用，從而抑制病毒復制，這可能有助于開發新的方法來治療CSFV感染。Zhang等[32]研究發現熱激蛋白70與CSFV NS5A的N末端氨基酸(29240)蛋白相互作用，并增強病毒復制；Li等[33]研究發現FKBP8和CSFV NS5A相互作用，并促進病毒復制；Liu等[34]研究表明真核生物翻譯起始因子3亞基E(eIF3E)與CSFV NS5A相互作用，并促進病毒復制。Li等[35]發現真核延長因子1A(eEF1A)與CSFV NS5A蛋白相互作用，并抑制病毒的生長；Ling等[36]研究發現熱休克蛋白27(Hsp27)與CSFV NS5A相互作用，并通過NF-κB信號通路抑制病毒復制；毒蛇毒蛋白通過與CSFV NS5A相互作用，并抑制病毒復制[37]。

8 NS5B蛋白

NS5B分子量大小約為82 kDa，由718個氨基酸殘基組成，是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，負責病毒基因組的復制。Xiao等[38]研究發現NS5B蛋白通過3′UTR與正鏈結合形成復合物，從而促進CSFV復制，且發現CSFV正鏈RNA的3′UTR“CCCGG”序列和負鏈RNA 3′UTR“CATTGCTC”序列是正鏈RNA和負鏈RNA合成必需的。Li等[39]研究結果進一步表明CSFV核心蛋白通過CSFV NS5B調節RNA的合成。此外，其他非結構蛋白與NS5B之間的相互作用在病毒的生命周期中發揮了重要作用。例如，Wang等[40]研究發現CSFV NS3通過與NS5B結合增強RdRp活性，也調節NS3的 NTP酶活性和解旋酶活性，之后，又進一步發現NS5B包含2個NS3結合位點，一個為NS5B N端的63～99 aa和另一個為C端的611～642 aa[41]。最近，Li等[42]通過對CSFV NS5B的晶體結構的研究，發現CSFV NS5B的N末端結構域(NTD)對于RdRp活性非常重要；Zhou等[43]研究發現豬poMx1與CSFV NS5B相互作用，抑制CSFV復制。這可能對開發抗CSFV藥物提供一定的思路。

9 展望

CSFV對我國乃至世界養豬業都造成了巨大的損失，研究人員近些年對于CSFV的研究已取得了顯著進展，但對在CSFV復制中發揮重要作用的如p7、NS2、NS3等非結構蛋白的研究還不透徹，非結構蛋白之間相互作用的調控機制、病毒復制的調控機制及致病機理等方面都需要不斷進行探索。對CSFV非結構蛋白的了解，有助于深入理解病毒的復制過程及病毒持續感染的分子機制。本文對在CSFV復制過程中起關鍵作用的非結構蛋白近年來的研究進展進行了匯總，以期為今后繼續研究CSFV非結構蛋白的科研人員提供參考，并對CSFV的鑒定、診斷及預防研究提供參考。