棗花柱頭熒光染色方法的優(yōu)化*

任海燕，王永康，趙愛(ài)玲，薛曉芳，李 毅，李登科

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太谷 030815）

棗落花落果嚴(yán)重，坐果率低，一般自然坐果率僅1%左右[1]，且棗胚敗育普遍存在[2]。許多學(xué)者針對(duì)這一現(xiàn)象，開展了棗柱頭可授性、花粉萌發(fā)情況、授粉受精等開花生物學(xué)特性的研究，國(guó)內(nèi)研究較多的使用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法（MTT）測(cè)定柱頭的可授性[3-6]，此方法雖快捷，但可授性強(qiáng)弱指標(biāo)難以量化。相比而言，利用熒光顯微法判斷柱頭可授性和花粉管生長(zhǎng)較為直觀準(zhǔn)確[7-11]。棗花柱微木質(zhì)化，花柱細(xì)胞組織較厚，在熒光顯微觀察時(shí)易出現(xiàn)花粉管生長(zhǎng)過(guò)程被花柱組織遮擋的現(xiàn)象，因此在試驗(yàn)過(guò)程中，常采用適宜濃度的NaOH作為軟化劑軟化花柱，可以達(dá)到預(yù)期的效果。但若NaOH濃度使用不當(dāng)，或出現(xiàn)花柱壓片不成形，或花粉管結(jié)構(gòu)不清晰等影響試驗(yàn)效果。為了提高棗花粉管生長(zhǎng)特性等相關(guān)試驗(yàn)的效率，以期得到理想的試驗(yàn)圖片，本研究以‘冷白玉’棗花為試材，對(duì)軟化方法、染色pH環(huán)境進(jìn)行了優(yōu)化，以期為棗花粉管生長(zhǎng)特性的研究提供實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料‘冷白玉’棗采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國(guó)家棗資源圃，該品種盛花期為6月上旬，選取無(wú)病、長(zhǎng)勢(shì)良好的棗吊，定花定果，以黃蕾期（蜜盤剛出蜜）進(jìn)行人工授粉，授粉品種為‘伏脆蜜’，花粉萌發(fā)率為94%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1材料

采集棗花，置于FAA（70%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=90∶5∶5）固定液中固定備用。

1.2.2不同軟化處理的優(yōu)化

從FAA中取出棗花，蒸餾水清洗10次，分別置于不同的條件進(jìn)行軟化：于8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min；于2 mol/L NaOH溶液中浸泡并文火水煮30 min；于8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒溫水浴中10 min。每處理重復(fù)3次，每次選取棗花30朵。

1.2.3不同pH值緩沖液處理的優(yōu)化

棗花經(jīng)過(guò)2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min軟化后，經(jīng)不同pH值梯度緩沖液（1 mol/L NaOH與45%冰醋酸配制而成），pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0，浸泡50 min。每處理重復(fù)3次，每次選取棗花30朵。

1.2.4不同染色劑處理的優(yōu)化

棗花經(jīng)過(guò)2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min軟化后清洗2～3次，經(jīng)緩沖液pH值為7.0浸泡50 min清洗后，置于不同的染色劑：0.1%水溶性苯胺藍(lán)，染色30 min；0.1 g水溶性苯胺藍(lán)+0.7 g K3PO4，蒸餾水定容至100 mL，加45%冰乙酸調(diào)至pH值為8.0，染色5 min。每處理重復(fù)3次，每次選取棗花30朵。

棗花染色后，蒸餾水清洗4～5次后，用刀片和鑷子取出雌蕊，放置在載玻片上，輕蓋蓋玻片，制片后在倒置熒光顯微鏡（Olympus DP71）下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaOH溶液處理對(duì)棗花雌蕊軟化效果的影響

如圖版2所示，棗花在8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min，花柱表面的花粉粒不清晰，花柱成形（圖版2-A-a）；棗花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min后，花粉管形態(tài)清晰可見(jiàn)，且花柱結(jié)構(gòu)基本保持完整（圖版2-A-b）；在8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒溫水浴中10 min，花柱表面的花粉粒可以看到，但花柱不成形、破裂，花粉管暴露，不能觀察到完整的花柱結(jié)構(gòu)（圖版2-A-c）。通過(guò)比較，棗花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min，軟化效果好，花柱結(jié)構(gòu)保持完整且花粉管清晰可見(jiàn)。

2.2 不同pH值緩沖液處理對(duì)花粉管染色效果的影響

當(dāng)緩沖液pH值為3.0時(shí)，花柱細(xì)胞呈藍(lán)色，花粉管染色與其他部分對(duì)比不明顯（圖版2-B-a）；當(dāng)pH值為5.0時(shí)，花柱細(xì)胞部分呈藍(lán)色，可觀察到少量的花粉（圖版2-B-b）；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，可清晰可見(jiàn)花粉管在花柱道中的伸長(zhǎng)情況，花柱呈透明狀，拍攝效果最佳（圖版2-B-c）；當(dāng)pH值為9.0時(shí)，花柱細(xì)胞呈黑色，可觀察到部分花粉粒，花柱與背景對(duì)比差，無(wú)法觀察到花粉管的伸長(zhǎng)情況（圖版2-B-d）。由此可見(jiàn)，當(dāng)緩沖液pH值為7.0時(shí)，觀察花粉萌發(fā)及花粉管伸長(zhǎng)情況，效果最佳。

2.3 不同染色劑處理對(duì)棗花粉管染色效果的影響

棗花經(jīng)緩沖液浸泡，蒸餾水清洗后在0.1%水溶性苯胺藍(lán)條件下，染液呈酸性，亮藍(lán)色，滴于白紙上有藍(lán)色染暈，染色30 min，觀察可見(jiàn)花柱表面花粉粒情況及花粉在柱頭萌發(fā)情況，但在花柱道中只可觀察到部分花粉管萌發(fā)，染色不明顯（圖版2-C-a）；在加有K3PO4的苯胺藍(lán)染液，pH值為8.0的條件下，染液呈暗藍(lán)色、清亮，滴于白紙上無(wú)染暈，染色5 min，染色效果好，可清晰觀察到花粉管萌發(fā)情況，花粉管結(jié)構(gòu)明顯（圖版2-C-b）。研究結(jié)果表明，在加有0.7 g K3PO4的0.1%水溶性苯胺藍(lán)溶液中花粉管清晰可見(jiàn)，染色效果好。

3 結(jié)論與討論

NaOH溶液的強(qiáng)堿性能可以很好地降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分[12-14]，從而達(dá)到軟化材料的效果。許多研究者利用NaOH軟化這一原理觀察花粉管生長(zhǎng)特性，但不同樹種所使用的NaOH濃度不同[15-17]。在棗方面，也有不少研究。王堯等[7]、張學(xué)英等[8]、李登科等[10]研究棗花粉萌發(fā)情況和授粉受精過(guò)程均使用8 mol/L NaOH進(jìn)行解離軟化花柱。邵鳳俠等[9]在對(duì)‘中秋酥脆棗’柱頭形態(tài)發(fā)育進(jìn)程與可授性研究中，使用的軟化劑為10 mol/L NaOH軟化10 h。本試驗(yàn)改變了以往使用NaOH浸泡的方式，而是使用2 mol/L NaOH，并進(jìn)行水煮的方式，使花柱組織得到了最大程度的透明化處理，這一結(jié)果在侯思皓等[11]研究棗花粉生長(zhǎng)特性中也同樣得到了證實(shí)。

本試驗(yàn)比較了3種軟化棗花的方法，認(rèn)為經(jīng)FAA固定的棗花，蒸餾水清洗5～6次后，浸泡在2 mol/L NaOH溶液中，文火水煮30 min，取出棗花蒸餾水清洗5～6次，在pH值為7.0的緩沖液中浸泡50 min，取出棗花清洗5～6次，然后進(jìn)行染色的方法，無(wú)需將棗花從FAA中取出進(jìn)行酒精梯度復(fù)水，簡(jiǎn)化了軟化步驟，避免了棗花柱結(jié)構(gòu)的破裂，使花柱組織得到了最大程度的透明化處理，花粉管觀察效果更佳，大大地提高了實(shí)驗(yàn)效率。

苯胺藍(lán)壓片觀察花粉萌發(fā)在很多植物上應(yīng)用廣泛，該方法簡(jiǎn)便、快捷、直觀，其原理是苯胺藍(lán)在堿性條件下與花粉管壁中的胼胝質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，在紫外光下發(fā)出黃綠色熒光[17]。苯胺藍(lán)染液在過(guò)酸或過(guò)堿環(huán)境中，染色效果均差。本研究結(jié)果證實(shí)了苯胺藍(lán)染液在pH值為8.0，染液呈暗藍(lán)色、清亮，滴于白紙上無(wú)染暈。棗花無(wú)需在苯胺藍(lán)染液中過(guò)夜染色，只需在pH值為8.0的苯胺藍(lán)染液染色5 min，即可制片后觀察，花粉管清晰，且與花柱細(xì)胞對(duì)比明顯，染色效果最佳。可見(jiàn)，相比傳統(tǒng)方法，圖片效果明顯改善，染液pH值的確定可提高實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。

傳統(tǒng)方法聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法是將柱頭浸于苯胺藍(lán)-過(guò)氧化氫反應(yīng)液中，通過(guò)觀察柱頭周圍是否呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量氣泡來(lái)判斷柱頭是否具有可授性。首先，這種方法需通過(guò)觀察柱頭染色顏色的深淺來(lái)判斷柱頭可授性的強(qiáng)弱，觀察結(jié)果無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)量化。其次，此方法反應(yīng)時(shí)間不一致，一般對(duì)于可授性弱的棗柱頭，反應(yīng)時(shí)間需10～15 min；而對(duì)于可授性強(qiáng)的柱頭，反應(yīng)時(shí)間也需3～5 min，才能觀察到結(jié)果[4-5]。相比而言，通過(guò)熒光顯微鏡能夠直觀地觀察到花粉管生長(zhǎng)的真實(shí)情況，能夠清晰、準(zhǔn)確地反映出授粉后各部分的動(dòng)態(tài)變化[18]。本文介紹的方法進(jìn)一步優(yōu)化了棗柱頭熒光染色方法，主要體現(xiàn)在以下幾方面。①簡(jiǎn)化了處理過(guò)程：將棗花從FAA液中取出后無(wú)需進(jìn)行酒精梯度復(fù)水。②花柱結(jié)構(gòu)保持完整，花粉管更為清晰：軟化處理只需浸泡在2 mol/L NaOH的溶液中，文火水煮30 min即可，無(wú)需在NaOH溶液中浸泡數(shù)小時(shí)，避免了較厚的棗花柱組織遮擋花粉管的現(xiàn)象。③節(jié)省了時(shí)間，更加高效：棗花在pH值為8.0的苯胺藍(lán)染液染色5 min即可制片后觀察，無(wú)需在苯胺藍(lán)染液中過(guò)夜染色，節(jié)省了時(shí)間。此外，染液pH值的確定大大地提高了實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。