Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法用于茶飲料抗氧化活性的評價

馬 天 ,王靜雨 ,張敏昕 ,張春發 ,張津津 ,馬 莉,2*

(1.河北醫科大學 公共衛生學院,石家莊 050017;2.河北省環境與人群健康重點實驗室,石家莊 050017)

我國是產茶和飲茶大國,由茶葉開發出的茶飲料是重要的暢銷飲料之一。茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱,是茶葉中具有保健功能的主要成分,包括兒茶素類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類化合物等。沒食子酸(GA,CAS 號:149-91-7)及7種兒茶素化合物[(－)-兒茶素(C,CAS 號:154-23-4)、(－)-表兒茶素(EC,CAS 號:490-46-0)、(－)-表沒食子兒茶素(EGC,CAS 號:970-74-1)、(－)-表兒茶素沒食子酸酯(ECG,CAS號:1257-08-5)、(－)-沒食子兒茶素(GC,CAS 號:3371-27-5)、(－)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG,CAS 號:4233-96-9)、(－)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG,CAS號:989-51-5)]占所有茶多酚總量的90%以上;其中,EGCG 約占50%,EGC 占約占20%,ECG 約占15%,EC 約占5%,它們是茶葉中的重要活性物質,清除自由基能力顯著,具有優異的抗氧化能力[1-4]。

目前,體外抗氧化活性評價方法很多,主要包括2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除法[5-8]、鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學發光法[9]和魯米諾-過氧化氫化學發光法[10]等。DPPH 自由基清除法是基于測定褪色程度的變化來評價抗氧化活性的[5]。DPPH 會產生一種氮自由基,其醇溶液呈紫色,在517 nm 處有強吸收,當加入抗氧化劑時,抗氧化物中活性氫解離并與DPPH 自由基結合,DPPH 自由基被清除,且被清除的自由基越多,溶液顏色越淺,溶液的褪色程度與吸光度的變化成正比,可用自由基清除率為50%時對應的抗氧化劑濃度即IC50來準確評價抗氧化劑的抗氧化活性[7],活性物質的IC50越小,則抗氧化劑對DPPH 自由基的清除能力越強,抗氧化能力越強。鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學發光法是通過測定化學發光強度的減弱程度來評價抗氧化活性的,鄰苯三酚在堿性條件下會被氧化產生超氧陰離子自由基(O2－·),O2－·將與魯米諾反應,產生含有一個電子的激發態中間產物,當這個中間產物返回基態時,會產生化學發光,而抗氧化劑能捕獲O2－·,使產生的化學發光強度減弱。魯米諾-過氧化氫化學發光法是通過測定化學發光強度的減弱程度來評價對過氧化氫中活性氧的清除能力的。在堿性條件下,過氧化氫-魯米諾體系會產生化學發光,且這種化學發光強度與過氧化氫含量成正比,抗氧化劑通過清除過氧化氫而使化學發光強度下降。

三價銀配合物[Ag(Ⅲ)]與魯米諾組成的化學發光體系也可用于測定抗氧化劑,抗氧化劑可與Ag(Ⅲ)發生氧化還原反應,并使體系的化學發光強度增強,增強的程度與抗氧化劑含量在一定范圍內成正比,已用于抗壞血酸[11]、多巴胺[12]、皮質醇[13]、青霉胺[14]等物質含量測定,但是用該方法評價茶飲料抗氧化活性的文章還未見報道。據此,本工作以Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法測定了茶葉中主要存在的沒食子酸和7 種兒茶素化合物,并同DPPH 自由基清除法、鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學發光法和魯米諾-過氧化氫化學發光法檢測結果比較,研究了該方法的可行性,以期為茶飲料抗氧化性能評價提供一種新方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動注射化學發光分析儀。

EGC、ECG、C、EC、GC、GA 標準儲備溶 液:0.01 mol·L－1,分別稱取一定質量標準品于小燒杯中,用少量乙醇溶解后轉移至10 mL 容量瓶中,用水稀釋至刻度。

EGCG 和GCG 標準儲備溶液:0.01 mol·L－1,取一定質量標準品,用水溶解并定容至10.0 mL。

其他所需濃度的標準溶液均由上述溶液用水逐級稀釋制得。

GA 標準品和魯米諾為分析純;C 標準品的純度不小于97%;EC、EGC、ECG、GC、GCG、EGCG和DPPH 標準品的純度均不小于98%;所用其他試劑均為分析純;試驗用水為高純水;綠茶、烏龍茶、茉莉花茶和紅茶飲料均采購于超市。

1.2 儀器工作條件

載流為純水,蠕動泵轉速為25 r·min－1,光電倍增管負高壓為600 V。裝置示意圖見圖1。

1.3 試驗方法

1.3.1 Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法

通過蠕動泵將氧化劑3×10－5mol·L－1Ag(Ⅲ)溶液(內含0.1 mol·L－1氫氧化鈉)和化學發光 劑1×10－7mol·L－1魯米諾溶 液(內 含0.01 mol·L－1氫氧化鈉)混合,再與載流混合流入檢測池,測定產生的化學發光基線強度。切換進樣閥,將樣品溶液(將茶飲料用水稀釋2 000倍制成)或1μmol·L－1的8種茶多酚化合物混合標準溶液由載液攜帶,與Ag(Ⅲ)溶液和魯米諾溶液的混合液混合后流入檢測池,測定由樣品或標準物質引入所產生的化學發光峰值強度,計算化學發光強度差值(化學發光峰值強度與基線強度的差值)。

1.3.2 DPPH 自由基清除法

圖1 裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the device

參考文獻[8],加入1μmol·L－1茶多酚化合物的混合標準溶液或用水稀釋2 000 倍的樣品溶液0.2 mL,再加入水0.8 mL和0.002 5 g·L－1DPPH溶液(介質為乙醇)5 mL,混合均勻,室溫避光反應30 min,以溶劑為參比,測定樣品在517 nm 處的吸光度,記為A樣品。以乙醇代替DPPH 溶液,測定吸光度,記為A空白。以水代替茶多酚化合物的混合標準溶液或樣品溶液,進行對照試驗,得到的吸光度,記為A對照。按公式(1)計算:

以8種目標化合物的濃度為橫坐標,以自由基清除率為縱坐標構建線性回歸方程,求出清除率為50%時對應的茶多酚化合物的濃度(IC50)。

1.3.3 鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學發光法

參考文獻[9],按1.3.1 節方法,其中,載流為Na HCO3-Na2CO3緩沖溶液,氧化劑為0.25 mmol·L－1鄰苯三酚溶液,化學發光試劑為0.4 mmol·L－1魯米諾溶液,其余儀器工作條件不變進行測定。

以8種目標化合物的濃度的自然對數為橫坐標,以自由基清除率為縱坐標構建線性回歸方程,求出清除率為50%時對應的茶多酚化合物的濃度(IC50)。

1.3.4 魯米諾-過氧化氫化學發光法

參考文獻[10],按1.3.1 節方法,其中,載流為Na HCO3-Na2CO3緩沖溶液,氧化劑為0.3%(體積分數)過氧化氫溶液,化學發光試劑為0.2 mmol·L－1魯米諾溶液,其余儀器工作條件不變進行測定。

以8種目標化合物的濃度的自然對數為橫坐標,以自由基清除率為縱坐標構建線性回歸方程,求出清除率為50%時對應的各茶多酚化合物的濃度(IC50)。

2 結果與討論

2.1 4種方法的結果分析

DPPH 自由基清除法(方法1)、鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學發光法(方法2)、魯米諾-過氧化氫化學發光法(方法3)和Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法(本方法)的測試結果見表1。

表1 4種方法的試驗結果Tab.1 Results of tests of the 4 methods

由表1可知:DPPH 自由基清除法所得的8種茶多酚化合物IC50按照從小到大排序依次為GCG、EGCG、EGC、GC、ECG、GA、C、EC,說明GCG 對DPPH 自由基的清除能力最強,EC 對DPPH 自由基清除能力最弱;鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學發光法所得的8種茶多酚化合物的IC50按照從小到大排序依次為ECG、GCG、C、EGC、EGCG、GC、EC、GA,說明ECG 對O2－·的清除能力最強,而GA對O2－·清除能力最弱;魯米諾-過氧化氫化學發光法所得的8種茶多酚化合物IC50按照從小到大排序依次為ECG、GCG、EC、EGCG、C、GA、EGC、GC,說明ECG 對過氧化氫清除能力最強,而GC清除過氧化氫的能力最弱;Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法所得的8種茶多酚化合物化學發光強度差值按照從小到大排序依次為EC、C、GA、ECG、GC、EGC、EGCG、GCG,說明GCG 與Ag(Ⅲ)的反應速度最快,最易被Ag(Ⅲ)氧化[15],抗Ag(Ⅲ)氧化活性最強,而EC與Ag(Ⅲ)的反應速率最慢,說明其最難被Ag(Ⅲ)氧化,抗Ag(Ⅲ)氧化活性最弱。前3種方法得到IC50的排序不同,是由于不同的茶多酚化合物捕獲的活性物種不同(分別為DPPH 自由基、O2－·和過氧化氫活性氧),故表現出的抗氧化能力不同。DPPH 自由基清除法得到的8種茶多酚化合物的抗氧化能力大小排序與Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法的一致,這是由于這兩種方法的信號強弱均與釋放的活性氫和電子數目有關[16-17]。以DPPH 自由基清除法所得的IC50為橫坐標,以Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法所得的化學發光強度差值為縱坐標繪制了線性擬合曲線(圖2),其線性擬合方程為y＝－101.8x＋1 408,相關系數為0.949 0,進一步說明了2 種方法具有較好的相關性。

圖2 2種方法的相關性Fig.2 Correlation between the 2 methods

2.2 樣品分析

按照1.3.1節和1.3.2節試驗方法,將Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法和DPPH 自由基清除法分別用于市售綠茶、烏龍茶、茉莉花茶和紅茶飲料的抗氧化活性分析。結果表明:DPPH 自由基清除法所得的抗氧化能力綠茶最強,紅茶最弱,烏龍茶和茉莉花茶能力相當;而Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法所得的化學發光強度差值排序按照從大到小的排序依次為綠茶、烏龍茶、茉莉花茶、紅茶。

以DPPH 自由基清除法所得自由基清除率為橫坐標,以Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法所得的化學發光強度差值為縱坐標繪制線性擬合曲線(圖3),所得相關系數為0.966 5,說明Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法也能用于茶飲料中抗氧化活性的評價。

本工作采用Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學發光法和文獻報道的其他3種方法評價了8種茶多酚化合物的抗氧化活性,結果顯示,本方法與DPPH 自由基清除法具有較好的一致性。將該法應用于4種茶飲料抗氧化活性的評價,所得結果也與DPPH 自由基清除法的一致,說明本方法可用于茶飲料的抗氧化活性評價。

圖3 實際樣品分析中2種方法的相關性Fig.3 Correlation between the 2 methods in analysis of the actual samples