高效液相色譜法測定慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12的含量及含量均勻度的評價

梁秋霞,陳 瀚,黃麗麗,朱健萍,盧日剛

(廣西壯族自治區食品藥品檢驗所,南寧 530021)

慶大霉素普魯卡因維B12膠囊是由硫酸慶大霉素、鹽酸普魯卡因、維生素B12等3種原料及適量輔料[內含淀粉、玉米淀粉、黏合劑、羧甲基纖維素、硬脂酸鎂、70%(體積分數)乙醇溶液等]組成的復方口服制劑。每粒慶大霉素普魯卡因維B12膠囊含有20 000單位慶大霉素、0.1 g鹽酸普魯卡因、0.01 mg維生素B12,在臨床上主要用于緩解急、慢性胃炎等,具有消炎、止痛、促進胃黏膜修復等功效?，F行標準為《國家藥品標準》化學藥品地方標準上升國家標準 第六冊WS-10001-(HD-0524)－2002《慶大霉素普魯卡因維B12膠囊》、國家食品藥品監督管理局標準YBH 20972006(浙江天瑞)《慶大霉素普魯卡因維B12膠囊》和國家食品藥品監督管理局標準YBH 15222004(?？谄媪?《慶大霉素普魯卡因維B12膠囊》。維生素B12在該制劑中含量很低,但它作為制劑中的主要成分,其含量是關鍵控制指標,但現行的標準中未設與維生素B12相關的鑒別、檢查及含量測定等項目。為確保用藥安全,需建立準確、靈敏的分析方法來測定該制劑中維生素B12的含量,避免因服用過量或不足帶來的危害[1-3]。

藥物制劑中維生素B12含量的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-7]、原子吸收光譜法[8]、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[9]、紫外吸光光度法[10]、可見吸收光譜法[11-12]、微生物法[13]等。雖然慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中的維生素B12和鹽酸普魯卡因均是具有共軛結構的水溶性物質,可采用HPLC中的紫外檢測器測定它們的含量,但普魯卡因不影響維生素B12的出峰;慶大霉素在檢測器上無響應,也不會干擾維生素B12的測定。文獻[14]采用液相色譜法快速分離和測定了慶大霉素普魯卡因維B12顆粒中維生素B12的含量,但該方法采用的測定儀器為裝有1.8μm 小粒徑色譜柱和擴展進樣環的超高效液相色譜儀,對于一般的分析實驗室,尤其是中小型藥物生產企業實驗室,這種條件要求較高,不能普遍應用。由于目前尚未見慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12含量測定的報道,本工作采用HPLC測定了47批慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12的含量,并評價了不同廠家生產的相同批次或不同批次樣品中維生素B12的含量均勻度,以期為完善和提高慶大霉素普魯卡因維B12膠囊質量標準提供依據。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(DAD);KQ-500DB型超聲波清洗器;XS 205DU型電子分析天平;Milli-Q Reference型超純水機。

維生素B12對照品儲備溶液:100 mg·L－1,稱取維生素B12對照品(批號100248－2002)約10 mg,用水溶解并定容至100.0 mL,搖勻。

維生素B12標準溶液系列:取適量維生素B12對照品儲備溶液,用水作為溶劑逐級稀釋,配制成0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5,3.0,5.0 mg·L－1的維生素B12標準溶液系列。

維生素B12對照品溶液:1.0 mg·L－1,稱取維生素B12對照品約10 mg,用水溶解并定容至100.0 mL,搖勻,用0.45μm 濾膜過濾,取1 mL 濾液置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻。

甲醇為色譜純;磷酸氫二鈉等其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

用于測定含量的慶大霉素普魯卡因維B12膠囊樣品共47批,分別為A 廠3批、B廠3批、C廠3批、D廠38批;用于評價含量均勻度的樣品共6批,分別為A廠1批、B廠1批、C廠1批、D廠3批。

1.2 儀器工作條件

CAPCELL PAK ACR C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;流量1 mL·min－1;進樣量100μL;檢測波長362 nm。流動相:A 為甲醇,B為0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.2)。梯度洗脫程序:0～3 min時,A 為15%;3～15 min時,A 由15%升至28%,保持2 min;17～19 min時,A 由28%降至15%,保持6 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品中維生素B12含量的測定

取出同廠同批次的20顆慶大霉素普魯卡因維B12膠囊內容物并將其混合均勻。稱取適量內容物(其中維生素B12質量約為10μg),加水約5 mL,超聲5 min(控溫25 ℃),用水定容至10.0 mL,搖勻,用0.45μm 濾膜過濾,濾液即為含量測定用供試品溶液A。每批樣品制備兩份供試品溶液A,按照儀器工作條件測定其中維生素B12的含量。

1.3.2 含量均勻度評價

取慶大霉素普魯卡因維B12膠囊1 粒,加水約5 mL,超聲5 min(控溫25 ℃),用水定容至10.0 mL,搖勻,用0.45μm 濾膜過濾,濾液即為含量均勻度測定用供試品溶液B。每批樣品制備10份供試品溶液B,按照儀器工作條件測定其中維生素B12的含量,用于含量均勻度評價。

1.3.3 陰性樣品溶液的制備

按各企業處方稱取輔料,按供試品溶液A 的制備方法制備陰性樣品溶液,按照儀器工作條件測定其中維生素B12的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對維生素B12對照品溶液、供試品溶液A、陰性樣品溶液進行測定,所得色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液、供試品溶液A 和陰性樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference solution,test solution A and negative sample solution

由圖1可知:供試品溶液A 中維生素B12的保留時間為14.98 min,與相應對照品溶液的一致,而陰性樣品溶液在相同保留時間處無色譜峰,表明輔料對維生素B12的測定無干擾。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相

試驗考察了分別以甲醇-水體系、甲醇-磷酸二氫鉀溶液體系、甲醇-0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液體系作為流動相時對維生素B12測定的影響。結果表明:以甲醇-0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.2)體系進行梯度洗脫時,慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12可以和鹽酸普魯卡因有效分離,且維生素B12的保留時間適宜、峰形較好,能夠滿足分析要求。因此,試驗選擇的流動相為甲醇-0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.2)體系。

2.2.2 檢測波長

利用DAD 的在線掃描功能,在波長200～800 nm 內對對照品溶液進行紫外吸收光譜掃描,結果見圖2。

圖2 維生素B12的紫外掃描光譜圖Fig.2 UV scanning spectrum of Vitamin B12

由圖2可知:維生素B12有兩個吸收峰,分別在362,550 nm 處。在實際測試時發現,550 nm 處的基線較362 nm 的平穩,但此處的吸光度僅為362 nm 處的30%。由于樣品中維生素B12的含量較低,綜合考慮靈敏度和穩定性等因素,試驗選擇的檢測波長為362 nm。

2.3 標準曲線和測定下限

按照儀器工作條件對維生素B12標準溶液系列進行測定,以維生素B12的質量濃度為橫坐標,其對應的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,標準曲線的線性范圍為0.2～5.0 mg·L－1,線性回歸方程為y＝98.32x－2.320,相關系數為1.000。

以10倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),所得結果為0.12 mg·L－1。

2.4 儀器精密度試驗

按照儀器工作條件對維生素B12對照品溶液分別測定6次,得到維生素B12峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.2%。

2.5 穩定性試驗

將供試品溶液A 分別放置0,2,4,8,12,16 h后,在儀器工作條件下測定,得到維生素B12的峰面積的RSD 為0.60%。

2.6 重復性試驗

取A 廠的慶大霉素普魯卡因維B12膠囊(批號為17011501),按試驗方法制備6份供試品溶液A,分別在儀器工作條件下測定,得到維生素B12的測定值為標示量的94.4%,測定值的RSD 為1.5%。

2.7 回收試驗

取A 廠批號為17011501 的樣品9 份,每份約0.1 g,溶解后分別置于10 mL容量瓶中,分為3組,每組3份,每組分別對應加入5.0 mg·L－1維生素B12對照品溶液3.0,5.0,7.0 mL,按試驗方法制備供試品溶液A 并測定,計算維生素B12的回收率,結果見表1。

表1 回收試驗結果Tab.1 Results of tests for recovery

由表1可知,維生素B12的回收率為96.9%～102%。

2.8 原輔料相容性試驗

參考文獻[15],試驗考察了由4個生產企業提供的輔料對測定的影響。將維生素B12和輔料按質量比1∶5的比例進行混合,然后按1.3.1節方法進行原輔料相容性試驗,同時與相同質量濃度的維生B12對照品溶液的測定結果進行比對。若兩者的峰面積差別明顯,則應對產生這種差異的原因進行進一步的探究。結果顯示,兩者維生素B12的峰面積基本無差別,說明所用輔料對維生素B12的含量測定無明顯影響。

2.9 樣品分析結果的差異及原因分析

按1.3.1節方法測定47批樣品中的維生素B12含量,并參考中國藥典二部中對于制劑有效成分含量的計算方法,計算測定值的相對質量百分數(相對于標示量),所得結果和結果分布圖見表2和圖3。/

表2 47批樣品分析結果Tab.2 Analytical results of 47 batches of samples

圖3 4個廠家的47批樣品中維生素B12的測定結果分布圖Fig.3 Results distribution of Vitamin B12in the 47 batches of samples from 4 manufacturers

中國藥典二部中對于主成分含量限度的要求一般為標示量90.0%～110.0%,因慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12的標示量較低(每粒僅含10μg),故可將此限度放寬至80.0%～120.0%。由表2結果可知:在所分析的47 批樣品中,來自A廠、B廠、C廠的9批樣品中的維生素B12的相對質量百分數為95.0%～110.0%,均在要求的范圍內;D 廠的為55.4%～137.0%,超出要求的范圍,異常樣品有9批,其中,有1批樣品的測定值小于標示量的80.0%,有8 批樣品的測定值大于標示量的120.0%,推測可能和樣品的均勻度有關。

為了考察相同批次或不同批次樣品的均勻度,按1.3.2節試驗方法將A 廠、B 廠、C 廠各一個批次和D 廠3個批次共計6批樣品制成供試品溶液B,并對其中維生素B12含量進行測定。每批制備10個供試品溶液,計算測定值的相對質量百分數(相對于標示量),并計算了測定值的標準偏差(s)、標示量與測定值之差的絕對值(A)以及判別結果(L,L＝A＋2.2s),結果見表3。

表3 6批樣品含量均勻度試驗結果Tab.3 Results of test for content uniformity of 6 batches of samples

根據中國藥典二部中對于主成分含量的要求及膠囊樣品中維生素B12的標示量較低的特點,將含量均勻度判別結果L值的限值定為±25.0%。表3結果顯示,A 廠、B廠、C 廠的3批樣品的L值均小于20.0%,D 廠的3批樣品的L值均大于25.0%。試驗還發現:D 廠的供試品溶液B 的顏色有深有淺,而D 廠所用輔料均為非紅色,而維生素B12原料為深紅色結晶或結晶性粉末,說明溶液顏色差異可能與維生素B12含量差異有關;D 廠同一批10個供試品溶液B 中維生素B12相對質量百分數波動較大,在70.0%～300.0%內浮動。由此可知,是D 廠樣品批次內與批次間樣品中的維生素B12含量的不均勻導致了D 廠的部分樣品含量的差異。

試驗分析了D 廠維生素B12含量不均勻的原因。從原輔料相容性試驗結果可知,原輔料對維生素B12的含量無明顯影響。從A 廠、B 廠、C 廠以及D 廠反饋的調查問卷情況及實地調研可知:D 廠采用干法混合三種主成分和輔料,而A 廠、B 廠和C廠均先采用水或70%(體積分數)乙醇溶液將維生素B12溶解后,再采用噴灑的方式與其他材料混勻。由此推測,D 廠批內和批間樣品中維生素B12含量的不均勻可能與干法混合工藝有關。因此,建議D 廠開展核查工作,確定干法混合工藝是否與維生素B12含量不均勻相關,以便提高產品質量。

本工作建立了測定慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12含量的高效液相色譜法,并對不同廠家同一批次或不同批次樣品中的維生素B12含量均勻度進行了評價,并查找了產生含量不均勻的原因。該方法具有操作簡單、準確度高、穩定性和重復性好,所需的分析時間與超高效液相色譜法的接近等優點,可為慶大霉素普魯卡因維B12膠囊質量標準的提高提供依據。