國外引進辣椒DNA表觀遺傳多樣性分析

徐小萬，夏碧波，吳智明，田永紅

（1.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣州510640；2.仲愷農業工程學院園藝園林學院，廣州510225）

作物育種能否取得突破性的成就取決于關鍵性種質資源的開發利用，種質資源成為作物雜交育種成功的重要因素［1］。依據外觀形態鑒別辣椒（Capsi?cumspp.）種質資源的親緣關系已有大量例子，隨著生物技術的發展利用分子標記技術，如RFLP［2］、RAPD［3，4］、ISSR［5，6］、AFLP［7］、SSR和SRAP［8］，研究者利用這些分子標記技術開展了辣椒種質資源親緣關系和遺傳多樣性分析，均取得了較好成績。DNA甲基化在基因表達調控和基因組防御2個方面發揮了重要作用［9］，是現代表觀遺傳學研究中的熱點和主要內容。近年來，隨著分子生物學的發展DNA甲基化的檢測方法越來越多，較簡單的方法是甲基化敏感擴增多態性（Methylation-sensitive amplified poly?morphism，MSAP），而MSAP是基于AFLP基礎上建立起來的技術，在水稻［10］、蔬菜［11，12］、毛竹［13］等植物DNA甲基化模式或程度上已被廣泛使用。本研究利用MSAP技術以國外引進的30份辣椒種質資源作為研究對象進行辣椒基因組CCGG甲基化位點多態性分析，以期為辣椒種質的分類鑒定以及種質資源科學利用提供表觀遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

30份辣椒種質資源由廣東省農業科學院蔬菜研究所茄果類研究室提供，均引自馬來西亞，其中8份資源田間表現抗疫病和青枯病，編號分別為156、159、162、163、168、181、182和198。

1.2 葉片DNA的提取

在辣椒苗期于第七片或第八片真葉時采集新鮮葉片，用于辣椒基因組DNA提取，提取方法參照CTAB法［1］。

1.3 MSAP反應體系

限制性酶切及連接反應，用EcoRⅠ/HpaⅡ組合和EcoRⅠ/MspⅠ組合分別酶切同一辣椒基因組DNA，酶切連接一步反應，混勻后離心數秒，37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過夜。反應體系：在20μL反應體系中，加入4μL模板DNA（50 ng/μL），Adapter 1μL，10×Reaction buffer 2.5μL，2μLEcoRⅠ，2μLMspⅠ或2μLHpaⅡ，10 mmol/L ATP 2.5μL，T4連接酶1μL，最后用ddH2O補足體系。預擴增和選擇性擴增具體參照李濤等［1］的方法。MSAP所用的接頭和擴增引物序列見表1。

表1 MSAP所用的接頭和擴增引物序列

1.4 MSAP數據讀取及統計分析

MSAP數據讀取［1，14］，具體按以下方法執行：①每個辣椒樣品占1個泳道，每個泳道加入的熒光分子量標準ROX-500，共25條帶；②選擇性擴增產物利用聚丙烯酰胺進行凝膠電泳，而后用測序儀ABI377自動保存膠圖；③利用GENESCAN軟件進行分析，每2個堿基讀1次數，每個泳道共讀取216個數；④打開保存好的膠圖，直接利用圖像信號生成分子量矩陣（Matrix），并采用BINTHERE軟件把生成的分子量矩陣轉為“0、1”二維矩陣，原則是根據記錄帶的有或無，有帶的記為“1”，而無帶的則記為“0”。根據“0、1”二維矩陣，對每個辣椒樣品統計4種帶型變化，Ⅰ型（1，1）HpaⅡ和MspⅠ都能切開、Ⅱ型（1，0）、Ⅲ型（0，1）、Ⅳ型（0，0），依據帶型分析各種甲基化模式在30個國外引進辣椒種質材料中的變化［1，14］。

為了研究國外引進30份辣椒種質資源表觀遺傳多樣性，將上述二維矩陣數據轉化為下列數據模式：第一套數據為甲基化不敏感多態矩陣（Methyla?tion-insensitive polymorphisms，MISP），將HpaⅡ和MspⅠ都能切開的Ⅰ型（1，1）記為數字“1”，將Ⅱ型（1，0）、Ⅲ型（0，1）和Ⅳ型（0，0）都記為數字“0”；第二套數據為甲基化敏感多態矩陣（Methylation-sensi?tive polymorphisms，MSP），將Ⅱ型（1，0）和Ⅲ型（0，1）都記為數字“1”，Ⅰ型（1，1）和Ⅳ型（0，0）記為數字“0”，采用NTSYSpc-2.10e軟件進行上述數據分析。

2 結果與分析

2.1 DNA甲基化模式分析

從63對引物組合中（表1）篩選出9對帶型清晰的MSAP引物，對國外引進的30份辣椒種質資源進行擴增和分析，圖1為引物對H1E2在30份辣椒種質資源中的MSAP擴增電泳圖譜。

由表2可知，國外引進的30份辣椒種質資源的甲基化模式分為以下3種類型。Ⅰ型為內側胞嘧啶半甲基化和5'-CCGG-3'胞嘧啶未甲基化，HpaⅡ和MspⅠ都能切開（1，1）；Ⅱ型為5'-CCGG-3'胞嘧啶外側半甲基化，HpaⅡ能切開，但MspⅠ切不開（1，0）；Ⅲ型為5'-CCGG-3'內側胞嘧啶全甲基化，HpaⅡ切不開，但MspⅠ能切開（0，1）。

圖1 引物對H1E2在30份辣椒種質資源中的MSAP擴增電泳圖譜

表2 國外引進30份辣椒種質資源MSAP分析的條帶類型

由表2可知，30份辣椒種質資源中，共統計到類型Ⅰ（1，1）3 535條，30份辣椒材料類型Ⅰ變化范圍為110（編號182材料）～197條（編號178材料），平均每份材料約145條；30份國外引進辣椒種質資源類型Ⅱ（1，0）共統計到4 593條，平圴每份材料約188條，其中最少的條帶數是78條（編號184材料），最多條帶數為292條（編號167材料）；而類型Ⅲ（0，1）在30份辣椒種質資源共統計到6 718條，平均每份材料約224條，其變化范圍從124（編號160材料）～292（編號169材料）；30份國外引進材料檢測到3種類型條帶總數為16 704條，平均每份材料約557條，其變化范圍從370（編號160材料）～683（編號172材料）；甲基化條帶總數為12 367條，平均每份材料約412條，其變化范圍從215（編號184材料）～544（編號172材料）；30份材料的甲基化敏感多態性平均為73.34%，最低為55.70%（編號184材料），最高為82.69%（編號167）。

由表2可知，30份國外引進的辣椒種質資源中有27份種質資源雙鏈內甲基化率都大于單鏈外甲基化率，而編號為156、167和192的3份種質資源的雙鏈內甲基化率都小于單鏈外甲化率。

2.2 MSAP非加權分組平均法分析

基于Jaccard相似性矩陣，采用非加權分組平均法進行聚類。由圖2可知，MSP聚類結果中，在相似性系數約為0.658處，30份國外引進材料可分為6個類群，第Ⅰ類：編號156、158、160、163、178、184、

182、183、192、180、181、171、173、162、168、159、174、198、190、157、166、164、165、177和175共25個材料；第Ⅱ類：只有編號199的材料；第Ⅲ類：只有編號169的材料；第Ⅳ類：只有編號191的材料；第Ⅴ類：只有編號172的材料；第Ⅵ類：只有編號167的材料。

圖2 采用UPGMA建立的30份辣椒種質資源MSP聚類分析結果

MISP聚類分析結果（圖3）表明，在相似性系數約為0.868處，30份國外引進辣椒材料可分為6個類群，第Ⅰ類：編號為156和157的2個材料；第Ⅱ類：編號為158、159、162、163、168、180、181、182、183、192、167、173、190、174、198、199、164、165、169、166、171、172、175和177，共24個材料；第Ⅲ類：只有編號184的材料；第Ⅳ類：只有編號160的材料；第Ⅴ類：只有編號191的材料；第Ⅵ類：只有編號178的材料。

圖3 采用UPGMA建立的30份辣椒種質資源MISP聚類分析結果

2.3 MSAP主坐標分析

主坐標分析基本證實了聚類分析的結果。在以相似性矩陣數據為基礎的2個主坐標分析過程中，在3個維度上均可以基本區分出絕大多數個體間的差異（圖4）。

圖4 國外引進30份辣椒種質資源MSP的三維主坐標分析結果

在MSP的三維主坐標分析（圖4）中，30份國外引進辣椒材料可分為5個類群，第Ⅰ類：編號156、158、160、163、178、184、182、183、192、180、181、171、173、162、168、159、174、198、190、157、166、164、165、177、175和199共26個材料；第Ⅱ類：只有編號167的材料；第Ⅲ類：只有編號191的材料；第Ⅳ類：只有編號172的材料；第Ⅴ類：只有編號169的材料。編號199的辣椒材料在UPGMA聚類分析中單獨分為一類，而在MSP的三維主坐標分析中聚在第一大類群中。進一步分析，MSP二維主坐標分析與三維主坐標分析的結果基本一致，只有編號為167和199的2個材料略有差異。

在MISP的三維主坐標分析（圖5）中，30份國外引進的辣椒材料可分為5個類群，第Ⅰ類：編號191、174、167、198、190、175、192、182、180、199、173、159、162、160、177、168、172、183、184、181、158、163、164、165、166和171，共26個材料；第Ⅱ類：只有編號156的材料；第Ⅲ類：只有編號157的材料；第Ⅳ類：只有編號169的材料；第Ⅴ類：只有編號178的材料。

圖5 國外引進30份辣椒種質資源MISP的三維主坐標分析結果

3 討論

3.1 基因組DNA甲基化

高等植物基因組中胞嘧啶甲基化是較普遍的現象，且其DNA甲基化比例變化大約在20%～50%［15］。本研究中30份國外引進的辣椒種質資源的DNA甲基化比例在55.70%～82.69%，高于臍橙的4.70%～15.00%［16］、毛 竹 的16.57%～21.23%［13］、水 稻 的20.00%［17］、擬 南 芥 的24.00%～34.00%［18］、芥 藍 的47.00%［12］、甘藍的53.30%～60.70%［19］。而有學者研究表明，牡丹的DNA甲基化比例在61.80%～79.00%［20］。

綜上所述，不同物種間的基因組甲基化水平存在較大差異［1］。研究表明，植物的甲基化變異還有另一個特點，存在位點特異性，這在擬南芥［21，22］和水稻［10］上已有驗證，從這個角度表明，植物的不同品種間具有明顯的DNA甲基化多態性。

DNA甲基化在植物中頻繁發生，物種間的甲基化模式存在較大的差異［1］，如芥藍［12］和臍橙［16］中“CCGG”序列甲基化模式以半甲基化為主，而枇杷［23］、銀杏［22］、辣椒［1］、橡膠樹［24］DNA甲基化的模式主要是以全甲基化為主。

本研究中30份國外引進的辣椒種質資源中有27份種質資源雙鏈內甲基化率都大于單鏈外甲化率，編號為156、167和192的3份種質資源單鏈外甲化率大于雙鏈內甲基化率，這可能與試驗方法有關，還有待于進一步研究。

3.2 MSAP聚類分析與主坐標分析

辣椒種質資源遺傳聚類遵守相同栽培種優先聚為一類的原則［1，5，25］，但是本研究MSP聚類和MISP聚類均比較離散，相關主坐標分析與其聚類分析結果基本一致。沒有將一年生辣椒聚為一個類群，由此表明，辣椒表觀遺傳變異相對于基因組遺傳變異更加豐富。有學者對不同生態環境的紅樹林進行MSAP研究表明，紅樹林有大量的DNA甲基化變異，而基因組變異較小［26］；也有研究認為不同生態性的植物可能甲基化調控機制不同，從而導致不同基因型植物之間的甲基化多態性不相關［1］，最后引起親緣關系比較緊密的植物也沒有歸為同一類，這在擬南芥［18］、短芒野大麥［27］和丹參［28］的遺傳與表觀遺傳研究中也有相似的結果。由上述分析可知，在植物DNA甲基化變異相對于DNA序列變異更具有普遍性。

3.3 遺傳多樣性與表觀遺傳多態性的比較

通過對形態學性狀［29］和ISSR［6］分子標記進行的遺傳多樣性分析表明，這2種分析方法基本上能把一年生辣椒聚為同一類，而DNA甲基化分析時采用MSP聚類和MISP聚類均不能把一年生辣椒聚為相同類群，表觀遺傳多樣性較遺傳多樣性更具有離散性。進一步分析表明，30份國外引進的辣椒DNA甲基化變異較基因組序列變異更為普遍。

采用ISSR分子標記的主坐標分析［6］，30份國外引進的辣椒種質資源有兩大主體區域聚集分布；而基于MSAP標記的MSP和MISP主坐標分析時，30份國外引進的辣椒種質資源的離散程度均大于ISSR分子標記的主坐標分析，一年生辣椒和其他栽培種并沒有各自為主體自行分布，與聚類分析結果相一致。由此說明，30份國外引進的辣椒種質資源表觀遺傳多樣性較遺傳多樣性更為豐富。