過量氟對體外培養LS8細胞中炎癥因子表達的影響

寇明清,馬志軍,李玨丹,阮建平

(1陜西省人民醫院CT室,西安 710068;2西安市第九醫院口腔科;3陜西省顱頜面精準醫學研究重點實驗室;4西安交通大學口腔醫院綜合科;5西安交通大學口腔醫院預防科;*通訊作者,E-mail:1009372603@qq.com)

氟牙癥是釉質發育期機體攝入過量氟引起的釉質發育不全,主要發生于高氟區,表現為牙釉質顏色改變甚至缺損,影響患者的顏面美觀和咀嚼功能,給患者造成嚴重的心理和生理障礙[1,2],然而,氟牙癥目前尚無理想治療方法。因此,深入探究氟牙癥發病機制,為開發篩選有效的氟中毒治療藥物進而解決我國重要的公共衛生與臨床治療問題提供新靶點。

本課題組[3,4]及Suziki等[5,6]的研究表明過量氟主要通過對成釉細胞的細胞毒性作用使釉質礦化受到影響,導致氟牙癥發生。過量氟可從多個方面對成釉細胞產生影響,包括蛋白合成、增殖、凋亡、分泌、內吞作用、鈣離子轉運及自噬[3,5-12],然而對炎癥反應的影響目前尚未見報道。本研究用過量氟干預體外培養LS8細胞,觀察其對細胞炎癥因子的表達影響,為解決我國重要的公共衛生與臨床治療問題提供線索和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

實時定量PCR儀(Agilent Technologies公司,美國),微量核酸蛋白定量儀Nano Drop2000(Thermo Fisher Scientific公司,美國),PCR儀(BIO-RAD公司,美國),蛋白電泳、轉印系統(Bio-Rad公司,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 LS8細胞培養與傳代 用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養液,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養LS8細胞,隔天換新鮮培養基。待細胞融合至培養瓶的70%-80%時,用胰蛋白酶消化細胞,按1 ∶4傳代培養。

1.2.2 氟化物處理LS8細胞 將LS8細胞接種到6孔板中孵育24 h,后加入含有濃度為2 mmol/L NaF的培養液,37 ℃,5% CO2分別培養0,12,24,48 h,收集細胞用于檢測IL-1β,IL-6,TNF-α及NF-κB mRNA水平。

將LS8細胞接種到6孔板中孵育24 h,后加入含有2.0 mmol/L NaF的培養液,37 ℃,5% CO2分別培養0,8,15,30,60,120 min,收集細胞用于檢測P38蛋白磷酸化水平。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞mRNA改變 Trizol試劑提取細胞總RNA,酶標儀測定OD260/280并檢測RNA濃度和純度。根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒操作說明,對2 μg總RNA進行反轉錄合成cDNA。使用實時定量PCR儀進行實時熒光定量PCR,PCR反應體系:5 μl SYBR Green PCR反應液、0.4 μl cDNA模板、1 μl PCR引物,加雙蒸水至10 μl。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環。β-actin為內參對照,采用2-ΔΔCt法對樣本進行相對定量。引物序列見表1。

1.2.4 Western blotting檢測細胞P38蛋白磷酸化水平改變 收集細胞,加入70 μl RIPA裂解液冰上裂解30 min,4 ℃下離心5 min,收集上清。BCA法檢測蛋白濃度,取細胞總蛋白15 μg,上樣量10 μl,5 μl Marker,進行10% SDS-PAGE電泳。在200 mA恒流條件下,轉膜1 h至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉PVDF膜2 h。后分別加入抗兔p-P38抗體(1 ∶1 000)、抗兔P38抗體(1 ∶1 000)、抗兔β-actin抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后用山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1.5 h。用TBST洗膜3次后,將PVDF膜置于凝膠成像分析系統實驗盒中,ECL發光液均勻放置于PVDF膜上,調整參數曝光后圖像分析儀處理。

2 結果

2.1 過量氟對LS8細胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達影響

2 mmol/L NaF分別干預LS8細胞12,24,48 h后,qRT-PCR結果顯示:IL-1β、TNF-α mRNA表達均呈時間依賴性增加,24 h和48 h時與0 h比較差異有統計學意義(P<0.05,見圖1);IL-6 mRNA表達在48 h時也顯著增加(P<0.05,見圖1)。

與0 h比較,*P<0.05圖1 過量氟對LS8細胞IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA的表達影響Figure 1 Effect of high fluoride on IL-1β,IL-6 and TNF-α mRNA levels in LS8 cells

2.2 過量氟對LS8細胞NF-κB mRNA表達影響

2 mmol/L NaF干預LS8細胞12,24 h,qRT-PCR結果顯示:NF-κB mRNA表達均顯著增加(P<0.05,見圖2)。

與0 h比較,*P<0.05圖2 過量氟對LS8細胞NF-κB mRNA的表達影響Figure 2 Effect of high fluoride on NF-κB mRNA levels in LS8 cells

2.3 過量氟對LS8細胞P38磷酸化影響

2 mmol/L NaF短時間(0-120 min)作用LS8細胞時,Western blotting結果顯示:P38磷酸化呈時間依賴性增加,即8 min和15 min時輕微增加,30 min時顯著增加,最大量的磷酸化在120 min時發生(P<0.05,見圖3)。

3 討論

氟牙癥發生主要有兩方面原因。一方面,由于地理環境中氟豐度過高,引起地區性氟牙癥流行,我國各省、市、自治區均有不同程度流行,以山東、陜西等省區病情較重;另一方面,人為攝入過量氟化物。當前飲水氟化、食鹽氟化等全身用氟防齲措施在全球多個國家被廣泛實施,含氟牙膏、含氟漱口水等局部用氟產品也已大量市場化,然而氟化物攝入又缺乏嚴格有效的指導和監督,從而導致氟牙癥發病率增加,呈散發態勢。然而,氟牙癥目前無理想治療方法。因此,深入探究氟牙癥發病機制,對解決我國重要的公共衛生與臨床治療問題具有重要意義。近年來,學者們針對成釉細胞的氟毒性作用進行了大量研究,發現過量氟可從多個環節對成釉細胞造成損傷進而影響釉質礦化,然而對炎癥的影響尚未見報道。因此,本研究著重觀察過量氟對體外培養LS8細胞炎癥因子的表達影響。

與0 min比較,*P<0.05圖3 過量氟作用LS8細胞不同時間P38磷酸化情況Figure 3 Effect of high fluoride on the phosphorylation of P38 in LS8 cells

IL-1β、TNF-α和IL-6都是典型的前炎性細胞因子,可與特定受體結合進而誘導細胞內信號級聯反應,在炎癥發生發展中起重要作用[13,14]。湯婷婷等[15]報道NaF可刺激小膠質細胞活化,并釋放TNF-α和IL-1β,而TNF-α和IL-1β的過量增多破壞血腦屏障,導致中樞神經系統損傷,然而在氟牙癥發生中,過量氟對成釉細胞炎癥因子的表達影響尚未見報道,本研究顯示過量氟可使LS8細胞中IL-1、TNF-α和IL-6表達均顯著增加,我們推測炎癥反應很可能參與了過量氟導致的LS8細胞損傷過程。

NF-κB信號通路在炎癥反應中起核心調控作用,可被應激、前炎癥因子等激活。研究發現IL-1β、TNF-α等可激活NF-κB,而活化的NF-κB進一步引起TNF-α、IL-6、IL-1β等的大量釋放,形成正反饋,進而引發持久的炎癥反應,嚴重時導致細胞死亡[15,16]。本研究中,過量氟作用于LS8細胞12,24 h后,結果顯示過量氟可增加NF-κB mRNA表達,提示NF-κB信號通路很可能參與了過量氟介導的LS8細胞炎性反應過程。

p38信號通路屬于MAPK家族成員之一,被認為是與炎癥反應關系密切的通路。磷酸化的P38可介導成骨細胞IL-1、TNF-α、IL-6等因子的產生,還可引起中性粒細胞活化[17]。本研究結果顯示過量氟可呈時間依賴性增加LS8細胞P38磷酸化表達,提示p38信號通路很可能參與了過量氟介導的LS8細胞炎性反應過程。

綜上所述,本實驗觀察了過量氟對LS8細胞炎性因子的表達影響,發現過量氟可增加IL-1β、TNF-α、IL-6、NF-κB mRNA以及p38蛋白磷酸化表達,提示過量氟可導致LS8細胞炎癥反應的發生,NF-κB及p38信號通路很可能參與其中。然而,NF-κB及p38信號通路在過量氟誘發LS8細胞炎癥反應過程中的作用機制,尚需深入探究。