LRP5蛋白對子宮內膜異位癥異位內膜的影響及機制

閆 坤,楚光華,王欣茹,胡春艷,劉 晨,陳 巍,李 佩

(1西北婦女兒童醫院婦二科,西安 710061;2西安市中心醫院普外科;3陜西省第二人民醫院婦產科;*通訊作者,E-mail:1913115956@qq.com)

子宮內膜異位癥是一種婦科常見病,這種疾病已成為不孕不育和盆腔疼痛的最重要原因之一,影響到6%-10%的育齡婦女[1,2]。雖然子宮內膜異位癥被認為是一種良性疾病,但它在臨床上仍表現出組織粘連、侵襲、血管生成等惡性生物學行為[3]。關于子宮內膜異位癥的病因,目前學術界已經存在諸多種見解,包括月經逆行、體腔上皮化生、遺傳和環境等因素。然而,子宮內膜異位癥的發病機制仍不清楚。

研究報告稱[4],子宮內膜異位組織中許多基因的異常表達可能會增加子宮內膜異位癥的風險。因此,檢測基因表達水平的改變,將為研究子宮內膜異位癥的發病機制提供新的思路。低密度脂蛋白受體相關蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5)在損傷的大鼠動脈內膜和外膜區域過表達,它可抑制膠原的形成并誘導細胞遷移[5]。同時,LRP5也在不同類型的惡性腫瘤和誘導腫瘤細胞遷移和侵襲中過表達[6]。最近的研究[7]表明,LRP5通過促進上皮-間充質轉化、促進細胞侵襲和通過眾多信號通路誘導血管生成來觸發癌癥轉移。

此外,LRP5通過靶向Wnt/β-catenin通路增加肝細胞癌、非小細胞肺癌和卵巢上皮癌的細胞侵襲力[8,9],該通路被認為是與細胞運動和增殖能力相關的關鍵途徑。然而,LRP5是否參與子宮內膜異位癥的進展及其潛在機制仍很不清楚。本研究旨在檢測LRP5在子宮內膜細胞和組織中的表達水平,進一步揭示子宮內膜異位癥發生發展的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM/F-12培養基、胎牛血清、SYBR PreMix ExTaq試劑盒和增強型化學發光試劑購于Thermo fish公司(美國);膠原酶Ⅰ、青霉素、GAPDH、細胞計數試劑盒-8(CCK-8)、RNA-IMAX購于Sigma公司(德國);70 μm細胞濾網購于BD Falcon公司(美國);鏈霉素購于Supelco公司(美國);細胞培養板購于NEST公司(中國);恒溫細胞培養箱購于AODEMA澳德瑪公司(中國);TRIzol RNA分離試劑購于Invitrogen公司(美國);PrimeScript RT試劑盒購于Takara公司(日本);酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司;Transwell小室購于Corning公司(美國);聚碳酸酯過濾器購于默克Millipore公司(美國)。LRP5小干擾RNA(siRNA;si-LRP5)和陰性對照siRNA(si-NC)由生工生物工程(上海)股份有限公司(中國上海)合成。LRP5抗體、β-catenin抗體、CD44抗體、CyclinD1抗體、MM7抗體、c-myc抗體、微管蛋白抗體以及抗鼠/抗兔二抗購自Cell Signaling公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集、制備及分組 在位子宮內膜組織和異位子宮內膜組織的標本分別取自2019年1-12月在本院接受腹腔鏡卵巢子宮異位內膜囊腫切除術和行常規宮腔鏡檢查的20例婦女[平均年齡(31.56±4.23)歲]的卵巢囊腫和子宮內膜組織標本。根據美國生殖醫學會修訂的子宮內膜異位癥分類[10],所有患者均被確診為Ⅲ-Ⅳ期子宮內膜異位癥。對照子宮內膜標本取自20例[平均年齡(30.62±3.72)歲]接受宮腔鏡治療子宮縱隔的婦女。此外,在手術前從子宮內膜異位癥組和對照組患者采集了血清樣本。

所有組織和血清標本在收集后30 min內用于細胞培養或放置在-80 ℃下保存。子宮內膜異位組織的納入標準為:月經周期正常,子宮內膜無腫瘤、息肉,無內分泌疾病或急性炎癥,在過去6個月內未接受激素治療。所有涉及人體血液和組織樣本的實驗獲得本院醫院倫理委員會的批準,研究參與者在樣本采集前簽署了書面知情同意書。

為確認異位內膜組織中LPR5的mRNA和蛋白表達水平是否發生改變,將患者子宮內膜組織標本分為在位內膜組(在位組,9例)和異位內膜組(異位組,11例),取正常子宮內膜組織作為對照組(20例)。為評價LRP5在子宮內膜異位癥進展中的作用,將異位子宮內膜間質細胞(ectopic endometrial stromal cells,EESC)分別轉染LRP5 siRNA(si-LRP5組)和空質粒的陰性對照(si-NC組)。

1.2.2 細胞培養 將5例腹腔鏡卵巢囊腫切除術后的異位內膜組織置于DMEM/F-12培養基(Gibco)中,切成小塊,在37 ℃恒溫水浴鍋中用膠原酶Ⅰ消化1 h,然后用70 μm的濾網去除殘留組織碎片和其他雜質。2 500 r/min離心8 min后,再懸浮于含10%胎牛血清(FBS;Gibco)和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F-12培養基中。隨后,將細胞懸液轉移到6孔板中并在37 ℃含5% CO2的恒溫細胞培養箱中進行培養。

1.2.3 cDNA與RT-qPCR分析LRP5表達水平 將保存的組織樣本從-80 ℃轉移到4 ℃,選取直徑約5 mm的組織,用TRIzol RNA分離試劑(InvitrogenTM)提取總RNA;PrimeScript RT試劑盒(Takara)用于cDNA合成。使用SYBR PreMix Ex Taq試劑盒(Thermofish)進行實時定量PCR(RT-qPCR)反應。每個組織樣本重復3次實驗,選擇GAPDH作為內參基因。用于RT-qPCR反應的引物序列均從GeneBank中檢索,并由生工生物工程(上海)股份有限公司(中國上海)合成。引物序列如下:LRP5-F,5′-AACGTGGTCATCTCCGGCCTGGTCTCT-3′;LRP5-R,5′-GGGGTCCAAGGCGATGGCCCTCGGCT-3′;GAPDH-F,5′-GCACCGTCAAGGCTGAAC-3′;GAPDH-R,5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。

1.2.4 Western blotting檢測蛋白表達水平 根據文獻[11]中的方法進行Western blotting實驗。收集內膜組織樣本或細胞,使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解處理,然后低溫高速離心收集蛋白樣品,使用BCA分析試劑盒測量蛋白濃度,總蛋白(20 μg)用10% SDS-PAGE分離,然后轉移到PDVF膜上,并在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h;然后將膜與一抗LRP5(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶5 000)、CD44(1 ∶1 000)、CyclinD1(1 ∶1 000)、MM7(1 ∶1 000)、c-myc(1 ∶1 000)和Tublin(1 ∶5 000)在4 ℃下孵育過夜。隨后,將它們與抗鼠/抗兔二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。使用增強型化學發光試劑檢測結合抗體復合物,并使用ImageJ軟件將微管蛋白表達歸一化后,用條帶密度計法測定相對蛋白表達量。每個組織或細胞樣本重復3次實驗。

1.2.5 酶聯免疫吸附試驗和siRNA轉染分析LRP5的相對水平 血清中可溶性LRP5濃度用酶聯免疫吸附分析法(ELISA)進行測定。將70%融合的異位子宮內膜間質細胞(EESC)接種到6孔板中,按照說明書,將siRNA與RNA-IMAX共轉染到細胞中。轉染72 h后,收集細胞,使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解出來,然后低溫高速離心收集蛋白樣品,經BCA分析試劑盒測量蛋白濃度后,總蛋白(20 μg)用10% SDS-PAGE分離,然后轉移到PDVF膜上,并在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h;然后將膜與方法1.2.4涉及的一抗在4 ℃下孵育過夜。隨后,將它們與抗鼠/抗兔二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。使用增強型化學發光試劑檢測結合抗體復合物,并使用ImageJ軟件將微管蛋白表達歸一化后,用條帶密度計法測定相對蛋白表達量并分析轉染效率。每個細胞樣本重復3次實驗。

1.2.6 細胞計數試劑盒-8(CCK-8)法測定細胞增殖 為評估轉染72 h后EESC的增殖能力,將細胞接種于96孔板中,每孔約4×103個細胞,然后用si-NC或si-LRP5做轉染處理。按照細胞計數試劑盒-8(CCK-8)說明書方法測定,使用Varioskan Flash微板讀取器(Thermo Science)分別在0,1,2,3,4 d測量450 nm處的吸光度變化。每組細胞樣本進行3次重復實驗。

1.2.7 Transwell和Matrigel分析細胞遷移和侵襲情況 使用Transwell小室和孔徑8 mm的聚碳酸酯過濾器進行Transwell遷移和Matrigel侵入分析。將si-LRP5或si-NC轉染EESC 48 h,然后分別以4×104和1×105個細胞/室懸浮于200 μl無血清DMEM/F-12培養液中進行遷移和侵襲實驗。隨后將懸浮細胞分別轉接含或不含Matrigel涂層至頂室。同時,將含有10%胎牛血清的500 μl DMEM/F-12放入底室。在37 ℃孵育24 h(遷移)或48 h(侵襲)后,取出保留在膜表面的細胞,用0.1%結晶紫染色,在光學顯微鏡下觀察(×200)。從每個腔室中隨機選擇5個視野,并使用ImageJ軟件計數每個視野中的細胞數量,取平均值。每組細胞樣本進行3次重復實驗。

1.2.8 傷口劃痕試驗分析細胞愈合情況 將細胞接種于6孔板中,然后用si-LRP5或si-NC轉染細胞,在培養箱中培養48 h,待EESC的細胞密度大于或等于95%,然后用200 μl無菌移液管的尖端刮擦細胞單層傷口。然后在無血清DMEM/F-12培養基中饑餓培養12 h,分別在0 h和12 h時間點于光學顯微鏡下(×100)采集圖像。使用ImageJ軟件計算細胞單層上愈合區域的大小,并使用ImageJ軟件分析計算傷口面積及愈合面積(打開ImageJ軟件,對劃痕圖片進行Process->Smooth平滑處理后,進行Process->Find Edges尋找邊緣,然后進行劃痕面積分析,即可計算傷口或愈合面積)。其相對傷口面積=轉染后12 h的傷口面積/轉染后0 h的傷口面積;其相對愈合面積=轉染后12 h的愈合面積/轉染后0 h的愈合面積。每組細胞樣本進行3次重復實驗。

1.2.9 流式細胞術和熒光激活細胞分選分析細胞周期 為進行流式細胞術分析,取對數生長期的EESC細胞,按1×105個細胞/ml以1 ml接種于100 mm培養皿內;24 h后,將si-LRP5或si-NC轉染EESC并繼續培養48 h。收集細胞,并用低速離心機離心(1 000 r/min,5 min);使用預冷的PBS洗滌細胞2次后,加入3.5 ml無水乙醇混勻細胞,于4 ℃固定30 min后,再次使用預冷的PBS洗滌細胞;然后加入200 μl和2 μl RNA酶于37 ℃孵育30 min,加入PI進行避光染色30 min后,進行流式細胞術分析。使用細胞周期染色試劑盒和FACS系統(美國)對轉染的EESC進行熒光激活細胞分選(FACS)。每個細胞樣本進行3次重復實驗。

1.3 數據統計分析

采用SPSS19.00軟件進行統計學檢驗,所有數據均以平均數±標準差表示。兩組間比較進行t檢驗分析,多重比較采用單因素方差分析,然后進行Newman-Keuls檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LRP5在子宮內膜異位組織和血清中高表達

與在位組和對照組相比,異位組患者子宮內膜異位組織中LRP5的mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.01,見圖1)。ELISA法檢測血清可溶性LRP5濃度,結果顯示,子宮內膜異位癥患者血清中LRP5濃度明顯高于對照組(P<0.01,見圖2)。

A.Western blotting檢測LRP5的表達 B.RT-PCR檢測LRP5 mRNA表達水平與對照組比較,**P<0.01;與在位組比較,##P<0.01圖1 LRP5在各組子宮內膜中的表達Figure 1 The expression of LRP5 in endometrium

與對照組比較，**P<0.01圖2 異位癥患者血清中可溶性LRP5的含量變化Figure 2 Content of soluble LRP5 in serum of endometriosis by ELISA

2.2 LRP5基因敲除降低EESC體外增殖能力

CCK-8檢測結果顯示,從第2天起,si-LRP5組EESC的增殖能力均顯著低于si-NC組(P<0.01,見圖3)。

與si-NC組比較,**P<0.01圖3 CCK-8檢測si-NC組和si-LRP5組EESC的增殖情況Figure 3 Proliferation of EESC in si-NC group and si-LRP5 group by CCK-8

2.3 LRP5基因敲除降低EESC體外遷移和侵襲能力

Western blotting分析結果顯示,si-LRP5組EESC中LRP5的表達水平相較于si-NC組明顯降低(P<0.01,見圖4)。傷口劃痕試驗以及Transwell遷移和侵襲試驗結果顯示,與si-NC組相比,si-LRP5組EESC的遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01,見圖4,5)。

與si-NC組比較,**P<0.01圖4 LRP5基因敲除后對蛋白表達及細胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of LRP5 gene knockout on protein expression and cell migration

與si-NC組比較,**P<0.01圖5 LRP5基因敲除對異位子宮內膜間質細胞體外遷移和侵襲能力的影響Figure 5 Effect of LRP5 gene knockout on migration and invasion of ectopic endometrial stromal cells in vitro

2.4 LRP5基因敲除降低EESC S期細胞的比例

流式細胞儀分析結果顯示,與si-NC組比較,si-LRP5組EESC中G1期細胞比例較高,S期細胞比例較低(P<0.01),而G2/M期細胞變化不顯著(P>0.05,見圖6)。

圖6 si-NC組和si-LRP5組EESC在不同細胞周期時的比例Figure 6 Ratio of EESC in different cell cycles in si-NC group and si-LRP5 group

2.5 下調LRP5表達對Wnt/β-catenin通路的影響

Western blotting對Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin、MMP7、c-myc、CD44和CyclinD1的檢測結果顯示,轉染72 h后,與si-NC組相比,si-LRP5組EESC中β-catenin、MMP7、c-myc、CD44和CyclinD1的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01,見圖7)。

與si-NC組比較,**P<0.01圖7 LRP5基因敲除對Wnt/β-catenin通路蛋白表達的影響Figure 7 Effect of LRP5 gene knockout on Wnt/β-Catenin pathway protein expression

3 討論

雖然子宮內膜異位癥通常被認為是一種良性疾病,但異位內膜細胞可以表現出惡性的生物學行為,類似于腫瘤細胞[12,13]。這些惡性行為是由一系列因素誘發,這些因素在子宮內膜異位癥的發生發展中起至關重要的作用。

此前的研究表明,在子宮內膜異位組織和正常子宮內膜之間,許多基因的表達水平會發生變化,這與子宮內膜細胞的惡性行為有關[14,15]。有報道稱,LRP5在骨髓瘤和卵巢癌中的表達較高,促進了細胞的增殖、遷移和侵襲[16,17]。

然而,目前對LRP5與子宮內膜異位癥的病理關系知之甚少。因此,本研究通過檢測子宮內膜組織中LRP5的mRNA和蛋白表達水平,探討LRP5在異位子宮內膜間質細胞的(EESC)增殖、遷移和侵襲能力中的作用。本研究結果表明,LRP5在異位內膜組織中的表達高于正常子宮內膜組織,而在位內膜組織中的表達水平與正常子宮內膜組織相比無明顯差異。此外,LRP5基因敲除還影響EESC的增殖、遷移和侵襲。綜上所述,LRP5可能在子宮內膜異位癥的發病中起促進作用。

Wnt途徑是一條在進化上高度保守的途徑,影響許多細胞過程,如增殖、分化和自我更新等[18]。最具特征性的Wnt經典途徑是Wnt/β-catenin途徑,該途徑需要β-catenin的核轉位來啟動細胞內信號轉導[19]。在細胞核內,β-catenin可以與轉錄因子結合,從而影響Wnt靶基因的水平,如CD44、c-myc、MMP7和細胞周期蛋白D1(CyclinD1)[20]。有研究報道,通過靶向c-myc和CCND1可加速腫瘤細胞增殖,導致細胞周期調節異常和細胞凋亡[21]。Alapati等[22]的研究結果表明,LRP5可通過Wnt/β-catenin途徑誘導肝細胞癌的增殖、遷移和侵襲。因此,本研究重點探究了LRP5與Wnt/β-catenin通路的調控關系,結果表明與轉染si-NC相比,轉染si-LRP5的EESCz中β-catenin、MMP7、c-myc、CD44和CyclinD1的蛋白表達水平均顯著降低。提示LRP5可能通過Wnt/β-catenin途徑誘導EESC的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述,LRP5在子宮內膜異位組織中高表達,并通過Wnt/β-catenin途徑在EESC的增殖、遷移和侵襲過程中發揮重要作用。然而,仍需要更多的研究來確定LRP5在子宮內膜異位癥進展過程中的具體機制,以及它作為子宮內膜異位癥生物標志物和治療靶點的潛力。