異甘草素對小鼠急性肺損傷的保護作用及其機制

王貴佐,王 霜,陳芬芬,王水利,汪玲果,楊淑梅*

(1陜西省人民醫院呼吸與危重癥醫學科,西安 710068;2西安醫學院;3西安交通大學第二附屬醫院干部保健科;*通訊作者,E-mail:shumeiyanghx@163.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是常見的臨床危重癥,其常見病因有新型冠狀病毒、流感病毒、重癥肺炎、淹溺、有毒物質吸入等。目前臨床上以對癥治療為主,尚無有效的治療措施,中重度ARDS的死亡率高達40%[1]。因此急需尋找新的有效的治療方法。

研究發現氧化應激在ALI/ARDS的發病機制中起重要作用[2,3]。在創傷、感染、中毒、休克的環境因素作用下,Ⅱ型肺泡上皮細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞等結構性細胞可產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),以中性粒細胞為主的肺組織內浸潤的炎癥細胞亦可產生大量的ROS[4]。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等ROS主要的清除劑含量及活性顯著下降,導致ROS的產生超過機體的清除能力,進而導致蛋白質和DNA的氧化損傷及脂質的過氧化損傷[5]。因此減輕氧化應激,進一步重建氧化抗氧化損傷的平衡可能成為ALI/ARDS新的研究方向。

異甘草素(isoliquiritigenin,ISL)是一種發現于甘草根和其他幾種植物的類黃酮化合物,具有查爾酮結構(4,20,40-trihydroxy chalcone)[6]。研究發現,異甘草素具有抗炎癥、抗腫瘤及抗血小板聚集活性[7-9],研究進一步發現異甘草素通過調節核因子E2相關因子2信號通路(NF-E2-related factor 2,Nrf2),抑制氧化應激從而對急性胰腺炎小鼠模型發揮保護作用[6],然而異甘草素能否對LPS誘導小鼠急性肺損傷發揮保護作用尚未可知。

本研究利用LPS誘導小鼠急性肺損傷動物模型,探討異甘草素能否對LPS誘導小鼠ALI起保護作用,并進一步探索這種保護作用下可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

18只6-8周齡健康BALB/c雄性小鼠(SPF級),體質量22-25 g,由陜西省人民醫院實驗中心提供。異甘草素及脂多糖(LPS,Escherichia coli 055:B5)購于Sigma-Aldrich。兔抗小鼠Nrf2及內參Lamin B購買于Cell Signaling Technology;HRP標記的羊抗兔二抗購于Sigma-Aldrich;髓過氧化物酶(MPO)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒及超氧化物歧化酶(SOD)測試盒購買于南京建成生物工程研究所;TNF-α ELISA試劑盒購于R&D Systems;胞漿-胞核蛋白提取試劑盒由碧云天生物技術公司提供;RIPA裂解液購于西安赫特生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作和實驗分組 將18只小鼠采用隨機數字表法分為3組:對照組(Con組)、LPS組(LPS組)和異甘草素干預組(ISL+LPS組),每組6只。4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉小鼠。Con組給予60 μl無菌PBS溶液,LPS組、ISL干預組分別向氣管內滴注LPS(1 mg/ml)60 μl,異甘草素干預組在LPS給藥前1 h給予異甘草素(200 mg/kg)(異甘草應用5%DMSO溶解)腹腔注射。24 h后用10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射深度麻醉、處死小鼠。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺組織樣本的收集 用4 ℃預冷的無菌PBS 0.8 ml進行支氣管肺泡灌洗,重復灌洗3次,BALF的回收率高達75%。BALF離心10 min(4 ℃,1 000g)。分別收集上清和沉淀,上清液在-80 ℃保存備用。BALF中沉淀用100 μl無菌PBS重懸,并利用細胞計數板進行細胞總數計數。取細胞沉淀涂片進行瑞氏-吉姆薩染色,在光鏡下分別行細胞總數及中性粒細胞計數。支氣管肺泡灌洗后分離右肺組織并在-80 ℃保存。

1.2.3 ELISA法檢測BALF中TNF-α濃度 采用ELISA方法檢測BALF中TNF-α的濃度。所有操作均嚴格按照R&D Systems試劑盒說明書進行。

1.2.4 肺組織病理學檢查 對分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液進行固定,然后對左肺組織進行脫水,透明,石蠟包埋后切片(5 μm),進行蘇木精-伊紅(H&E)染色,觀察肺組織病理學改變。

1.2.5 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測 MPO活性是中性粒細胞功能標志和啟動標志,肺組織內中性粒細胞大量聚集可導致MPO活性顯著升高。稱取一定質量的肺組織,加入5倍體積4 ℃預冷的生理鹽水,利用超聲法制作組織勻漿,利用南京建成生物工程研究所提供的MPO檢測試劑盒在460 nm波長處進行比色測定,從而得出MPO的活力,其活力高低反應炎癥的嚴重程度。

1.2.6 肺組織勻漿丙二醛含量測定 肺組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量是體內脂質過氧化程度的標志物,可以間接反應肺組織損傷程度。根據MDA測試盒說明書操作,用分光光度計測定吸光度值,并通過如下公式算出待測樣品的MDA含量。

肺組織中MDA含量(nmol/mg)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(10 nmol/ml)÷待測樣品蛋白濃度(mg/ml)

1.2.7 肺組織勻漿SOD活力測定 SOD活性反應肺組織抗氧化能力的強弱。采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定SOD活力,具體原理為:黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應產生超氧陰離子自由基,可氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下可呈現為紫紅色,在550 nm處產生最大吸收峰,肺組織中SOD活力按下列公式計算:

肺組織勻漿中SOD活力(U/mg)=(對照OD值-測定OD值)/對照OD值÷50%×反應液總體積/取樣量(ml)÷待測樣品蛋白濃度(mg/ml)

1.2.8 免疫印跡法檢測Nrf2的細胞核易位變化 胞漿-胞核蛋白提取按照碧云天生物技術公司細胞胞漿-胞核蛋白提取試劑盒使用說明書進行操作:從-80 ℃冰箱中取出肺組織樣本,切取并稱量合適大小的肺組織塊,將肺組織剪切成細小的碎片,置于預冷后的玻璃勻漿器內,固定在冰上。將適量的細胞漿蛋白提取試劑A液和B液按照20 ∶1的體積比例均勻混合,在使用前加入一定量的PMSF,組織勻漿液的最終濃度應調整為1 mmol/L。每60 mg肺組織中加入200 μl組織勻漿液,緩慢旋轉玻璃勻漿器內的玻璃棒,使得肺組織塊充分研磨,直至溶液中無肺組織碎片,該過程在冰上進行。于冰上裂解15 min后,將玻璃勻漿器內的肺組織勻漿液移入離心管內,1 500 r/min,4 ℃離心5 min,保留細胞沉淀。每20 μl細胞沉淀中加入200 μl細胞漿蛋白提取試劑A(加入PMSF)。將離心管內的細胞沉淀高速劇烈渦旋數秒,使其完全懸浮分散開來。置于冰上裂解15 min,再向細胞沉淀中加入10 μl細胞漿蛋白提取試劑B,高速劇烈渦旋5 s,于冰上靜置1 min。再次高速劇烈渦旋5 s,隨后12 000 r/min,4 ℃離心5 min,此時提取到的上清液亦為細胞漿蛋白,分裝并標記,保存于-80 ℃冰箱待用,保留細胞沉淀;向細胞沉淀中加入適量細胞核蛋白提取試劑(加入PMSF)。將離心管內的細胞沉淀高速劇烈渦旋30 s,使其完全懸浮分散開。置于冰上,每隔2 min將細胞沉淀高速劇烈渦旋30 s,反復此過程30 min。12 000 r/min,4 ℃離心10 min,提取到的上清液即為細胞核蛋白,做好標記,存儲于-80 ℃冰箱備用。利用Western blotting檢測各組小鼠肺組織核內Nrf2的變化,應用Lamin B作為內參校正。

2 結果

2.1 異甘草素對肺組織病理改變的影響

LPS組肺泡及肺間質可見炎癥細胞大量浸潤,肺泡間隔增厚,正常的肺組織結構明顯被破壞;而應用異甘草素干預處理后,LPS誘導小鼠肺組織病理損傷顯著減輕(見圖1)。

A.Con組 B.LPS組 C.ISL+LPS組圖1 異甘草素對LPS誘導小鼠急性肺損傷病理改變的影響 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of isoliquiritigenin on pathological changes of lung tissue in LPS-induced acute lung injury mice (HE staining,×200)

2.2 異甘草素對肺組織內浸潤炎癥細胞的影響

與對照組相比,LPS組BALF內炎癥細胞總數及中性粒細胞數均顯著升高(P<0.01,見圖2)。而應用異甘草素干預處理后,LPS誘導小鼠肺組織內炎癥細胞的浸潤顯著減輕(P<0.01,見圖2)。

與對照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖2 異甘草素對LPS誘導小鼠肺組織內浸潤炎癥細胞的影響 (n=6)Figure 2 Effect of isoliquiritigenin on infiltration of inflammatory cells in lung tissue in LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.3 異甘草素對BALF中TNF-α的影響

與對照組相比,氣道內滴注LPS 24 h后,BALF中TNF-α的濃度顯著升高(P<0.01,見圖3);與LPS組比較,異甘草素組BALF中TNF-α濃度明顯下降(P<0.01,見圖3)。提示異甘草素可能抑制急性肺損傷小鼠炎性細胞因子的分泌,從而對急性肺損傷發揮保護作用。

與對照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖3 異甘草素對LPS誘導小鼠BALF中TNF-α的影響 (n=6)Figure 3 Effect of isoliquiritigenin on TNF-α in BALF in LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.4 異甘草素對小鼠肺組織MPO活性的影響

與對照組相比,LPS誘導小鼠氣道內滴注LPS 24 h后,肺組織內MPO活性顯著升高(P<0.01,見圖4),而給予異甘草素預處理后,MPO活性顯著下降(P<0.01,見圖4)。提示異甘草素預處理可顯著抑制LPS誘導小鼠急性肺損傷炎癥細胞浸潤。

與對照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖4 異甘草素對LPS誘導小鼠肺組織內MPO活性的影響 (n=6)Figure 4 Effect of isoliquiritigenin on MPO activity in lung tissue in LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.5 異甘草素對肺組織脂質過氧化產物MDA的影響

與對照組相比,LPS組肺組織脂質過氧化產物MDA含量顯著升高(P<0.01),而應用異甘草素治療后的小鼠,MDA含量顯著下降(P<0.01,見圖5),提示異甘草素具有抗氧化作用。

2.6 異甘草素對小鼠肺組織SOD活性的影響

與對照組相比,LPS組SOD活性顯著下降(P<0.01),而異甘草素組SOD活性較模型組有所升高(P<0.05,見圖6)。提示異甘草素可提高SOD活性,減輕氧化應激,從而對急性肺損傷發揮保護作用。

與對照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,#P<0.01圖5 異甘草素對LPS誘導小鼠肺組織MDA的影響 (n=6)Figure 5 Effect of isoliquiritigenin on MDA level in lung tissue of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

與對照組比較,*P<0.01;與LPS組比較,&P<0.05圖6 異甘草素對LPS誘導小鼠肺組織SOD活性的影響 (n=6)Figure 6 Effect of isoliquiritigenin on SOD activity in lung tissue of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

2.7 異甘草素對小鼠肺組織Nrf2細胞核易位的影響

本實驗進一步檢測了小鼠肺組織中Nrf2由胞質到胞核的易位變化。結果顯示對照組小鼠肺組織細胞核內Nrf2蛋白表達較弱,LPS組細胞核內的Nrf2蛋白水平較對照組稍有增加,但差異沒有統計學意義(P>0.05),異甘草素組小鼠肺組織內核蛋白Nrf2水平較LPS組小鼠顯著增加,為LPS組的1.37倍(P<0.01,見圖7)。

3 討論

本研究中,LPS組的肺組織病理顯示大量炎癥細胞浸潤,肺泡間隔增厚,正常的肺組織結構被破壞;以中性粒細胞為主的炎癥細胞在肺組織內大量浸潤;髓過氧化物酶活性顯著增加;BALF中TNF-α顯著升高,脂質過氧化產物MDA顯著升高,上述LPS組病理學、炎癥及氧化反應改變與Lopez-Agui-lar等[10]構建ALI/ARDS動物模型改變一致,提示ALI/ARDS小鼠模型構建成功。

與LPS組比較,#P<0.01圖7 異甘草素對LPS誘導小鼠肺組織Nrf2細胞核易位的影響 (n=6)Figure 7 Effect of isoliquiritigenin on the nuclear translocation of Nrf2 in lung tissues of LPS-induced acute lung injury mice (n=6)

本研究中發現LPS組肺組織炎癥細胞大量浸潤,促炎因子TNF-α的濃度顯著升高,MPO活性明顯增加,脂質過氧化產物MDA顯著升高,與之相伴隨的是組織抗氧化能力SOD顯著下降。上述模型組改變提示在LPS刺激下,炎癥及氧化應激參與ALI/ARDS發病機制,而應用異甘草素干預后,炎癥細胞的浸潤顯著減少,TNF-α的分泌減少,MPO活性下降,MDA產生減少,組織抗氧化能力SOD升高,提示異甘草素通過減輕炎癥反應及氧化應激對LPS誘導急性肺損傷發揮保護作用。

Nrf2主要定位于肺、肝、腎及持續暴露在環境中的組織如皮膚等。生理狀態下,Nrf2主要與其抑制劑Keap1結合,以其非活性狀態存在于胞漿中,在泛素蛋白酶體作用下迅速降解,以保持在生理狀態下Nrf2的低轉錄活性[11,12]。當細胞受到ROS刺激或在其他應激狀態下,Nrf2去乙酰化,Nrf2與Keap1解偶聯,促進Nrf2轉運進入細胞核,與抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)結合,激活靶基因,如hemeoxygenase-1(HO-1)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等表達,調控抗氧化酶或藥物轉運體的轉錄活性,從而發揮抗氧化損傷作用[13,14]。研究發現激活Nrf2通路,可增加HO-1及SOD1表達,減輕氧化應激及炎癥反應,對急性肺損傷發揮保護作用[15]。進一步研究發現異甘草素通過激活Nrf2信號通路,減輕氧化應激,從而對急性胰腺炎及實驗性腦出血動物模型發揮保護作用[6,16]。上述多個研究提示激活Nrf2信號通路可能成為疾病治療的新的靶點。本研究中發現對照組小鼠肺組織細胞核內Nrf2蛋白表達較弱,LPS組細胞核內的Nrf2蛋白水平較對照組稍有增加,但差異沒有統計學意義(P>0.05),而異甘草素治療組小鼠肺組織內核蛋白Nrf2水平較LPS組小鼠顯著增加(P<0.01),為LPS組的1.37倍,提示異甘草素通過激活Nrf2通路減輕炎癥及氧化應激反應,從而對LPS誘導ALI/ARDS小鼠發揮保護作用。

本研究提示異甘草素對LPS誘導小鼠急性肺損傷發揮一定的保護作用,這種治療作用可能與Nrf2激活有關。本研究為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的治療提供新的思路。