上調(diào)miR-126對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

尚 娟,祝 瑞

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院,南充市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,南充 637000;*通訊作者,E-mail:shangjuanzzyx@163.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是呼吸系統(tǒng)最常見的急危重癥之一,以肺組織過度炎癥反應(yīng)和微循環(huán)通透性增加為主要特征,已經(jīng)成為重癥醫(yī)學(xué)科患者死亡的主要原因之一[1]。ALI的病因多樣,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,但炎性反應(yīng)失控在ALI發(fā)病過程中的作用已經(jīng)得到公認(rèn)[2]。目前臨床上對(duì)于ALI的治療以對(duì)癥支持治療為主,仍缺乏特異性藥物和有效的治療手段,死亡率仍居高不下[3]。因此探索能夠抑制ALI早期過度和失控炎癥反應(yīng)的有效手段意義重大。

微小RNA(miRNAs)是由19-25個(gè)核苷酸組成的小分子非編碼RNA,通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用,參與調(diào)控機(jī)體細(xì)胞許多重要的生命活動(dòng)[4]。近年來研究顯示miRNA在機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用,并且與ALI的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-126是血管和心臟、肺等組織器官的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的miRNA之一,參與多種免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能的調(diào)控[6,7],在機(jī)體炎癥方面起著重要的作用[8-10]。Huang等[11]通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)包括miR-126在內(nèi)的多個(gè)miRNA在ALI大鼠模型肺組織中表達(dá)降低,然而具體作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過體外構(gòu)建膿毒癥ALI小鼠模型,探索miR-126對(duì)小鼠ALI肺損傷的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

清潔級(jí)C57BL/6小鼠40只,雄性,8-10周齡,體質(zhì)量20-25 g,購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。LPS購自美國Sigma公司;agomiR-NC、agomiR-126購自上海吉瑪公司;髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自南京建成公司;IL-1β、TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;PCR引物購自廣州銳博生物公司;HMGB1、GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2 小鼠分組及ALI模型建立

40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為control組、ALI組、ALI+agomiR-NC組和ALI+agomiR-126組,每組10只。ALI組利用腹腔注射LPS(5 mg/kg)誘導(dǎo)建立ALI模型[12,13],ALI+agomiR-NC組和ALI+agomiR-126組在建立ALI模型后即刻,分別從尾靜脈給予注射agomiR-NC和agomiR-126(80 mg/kg),control組僅以等量的生理鹽水進(jìn)行腹腔和尾靜脈注射。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批文號(hào)20190105),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血?dú)夥治?ALI模型建立后24 h,用含肝素鈉注射器經(jīng)頸動(dòng)脈采血0.5 ml,在全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x上行動(dòng)脈動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值的檢測(cè)。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度的檢測(cè) ALI模型建立后24 h,頸椎脫臼法處死小鼠,開胸,結(jié)扎氣管和右側(cè)主支氣管,用1 ml注射器穿刺進(jìn)入左側(cè)主支氣管應(yīng)用0.3 ml PBS緩慢進(jìn)行肺泡灌洗3次,收集BALF,4 ℃離心取上清液,應(yīng)用IL-1β、TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒測(cè)定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度。

1.3.3 肺組織病理學(xué)觀察及肺損傷評(píng)分 取小鼠右肺上葉組織,4%多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋,行5 μm切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化,并參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行肺損傷病理評(píng)分。肺損傷病理評(píng)分依據(jù)肺泡出血、肺泡間隔水腫、肺泡內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià),根據(jù)病變程度分別賦分:0分,正常或者輕微病變;1分,輕度病變;2分,中度病變;3分,重度病變。

1.3.4 肺濕重/干重(W/D)比值的檢測(cè) 取右肺中葉及下葉組織100 mg,濾紙沾干表面水分,天平稱濕重后,放入80 ℃恒溫烘箱中烘烤48 h后,天平稱干重,計(jì)算W/D比值。

1.3.5 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測(cè) 取右肺中葉及下葉組織100 mg,液氮研磨后,RIPA裂解液冰上裂解,收集裂解液,4 ℃離心取上清液,采用MPO檢測(cè)試劑盒測(cè)定MPO活性。

1.3.6 肺組織中miR-126表達(dá)的檢測(cè) 采用qRT-PCR測(cè)定肺組織miR-126的表達(dá)。取右肺中葉及下葉組織,應(yīng)用Trizol提取肺組織總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照qRT-PCR試劑盒說明書反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-126引物正向:5′-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3′,反向:5′-CAUUAUUACUCACGGUACGAUU-3′;U6引物正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s,60 ℃,30 s,進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參,miR-126的表達(dá)采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.7 肺組織中HMGB1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法測(cè)定肺組織HMGB1蛋白的表達(dá)。取右肺中葉及下葉組織勻漿,加入RIPA裂解液提取蛋白并蛋白定量。取50 μg蛋白上樣,行10% SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉3 h,加入抗HMGB1(1 ∶1 000)和GAPDH一抗(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜,次日再加入二抗室溫孵育1 h,經(jīng)曝光顯影、照相,圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織miR-126、HMGB1蛋白表達(dá)水平的比較

與control組比較,ALI組小鼠肺組織miR-126相對(duì)表達(dá)明顯降低(P<0.05),HMGB1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺組織miR-126和HMGB1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺組織miR-126表達(dá)明顯升高(P<0.05),HMGB1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05,見表1,圖1)。

表1 各組小鼠肺組織miR-126、HMGB1蛋白表達(dá)水平的比較

圖1 各組小鼠肺組織HMGB1蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of HMGB1 protein in lung tissue of mice in each group

2.2 各組小鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較

與control組比較,ALI組小鼠動(dòng)脈血pH值和PaO2明顯降低(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠動(dòng)脈血pH值和PaO2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠動(dòng)脈血pH值和PaO2明顯升高(P<0.05)。各組小鼠動(dòng)脈血PaCO2明顯差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2 各組小鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較

2.3 各組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度的比較

與control組比較,ALI組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯增多(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯減少(P<0.05,見表3)。

表3 各組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度的比較

2.4 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變及肺損傷評(píng)分比較

control組小鼠肺泡形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰完整。與control組比較,ALI組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)雜亂,肺泡壁增厚,肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞,肺損傷病理評(píng)分明顯升高(P<0.05,見圖2、表4);與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺組織病理學(xué)改變相近,肺損傷病理評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺組織病變學(xué)改變明顯減輕,肺損傷評(píng)分明顯降低(P<0.05,見圖2、表4)。

圖2 各組小鼠肺組織的病理學(xué)改變 (HE染色,×200)Figure 2 Pathological changes of lung tissue in mice in each group (HE staining,×200)

表4 各組小鼠肺組織損傷評(píng)分、W/D比值、MPO活性的比較

2.5 各組小鼠肺W/D比值、MPO活性的比較

與control組比較,ALI組小鼠肺W/D比值、MPO活性明顯升高(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺W/D比值、MPO活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺W/D比值、MPO活性明顯降低(P<0.05,見表4)。

3 討論

膿毒癥是急性肺損傷發(fā)病的最常見原因之一,能夠直接或間接引起不同程度的肺損傷,嚴(yán)重者進(jìn)展為ARDS,病死率可高達(dá)60%[15]。過度炎癥反應(yīng)是膿毒癥誘發(fā)ALI的重要原因,但具體分子機(jī)制尚不清楚,如何有效控制ALI過程中過度炎癥反應(yīng),對(duì)于ALI的治療至關(guān)重要[16]。LPS是內(nèi)毒素的主要成分,進(jìn)入機(jī)體后快速誘發(fā)“炎癥風(fēng)暴”,導(dǎo)致彌漫性肺損傷,腹腔注射LPS制備ALI動(dòng)物模型是目前常用的理想方法[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn),ALI模型制備24 h后,小鼠動(dòng)脈血pH值和PaO2明顯降低,BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯增多,肺組織出現(xiàn)ALI典型的病理學(xué)改變,肺損傷評(píng)分、W/D比值、MPO活性明顯升高,提示本研究制備ALI模型成功。

近年來研究顯示miRNA在ALI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Li等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-33低表達(dá)參與了LPS誘導(dǎo)的ALI的發(fā)病機(jī)制。過表達(dá)miR-146b可以有效地抑制LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的炎癥反應(yīng),減輕肺組織損傷[20]。miR-16通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB通路和減輕炎癥反應(yīng),對(duì)小鼠ALI具有顯著的保護(hù)作用[21]。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)miR-19缺陷的小鼠肺組織更容易受到炎癥反應(yīng)的影響,恢復(fù)miR-19能夠減輕LPS誘導(dǎo)的ALI的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)miR-126與機(jī)體多種疾病的炎癥及免疫反應(yīng)有關(guān)[23,24],近期基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)包括miR-126在內(nèi)的多個(gè)miRNA在ALI大鼠模型肺組織中表達(dá)降低[11],miR-126在ALI肺組織中表達(dá)降低是否與炎癥反應(yīng)有關(guān)尚不清楚。本研究中我們通過qRT-PCR也發(fā)現(xiàn)ALI組小鼠肺組織miR-126表達(dá)明顯降低。進(jìn)一步我們通過對(duì)ALI小鼠尾靜脈注射miR-126模擬物成功上調(diào)ALI小鼠肺組織中miR-126的表達(dá),結(jié)果顯示,小鼠動(dòng)脈血?dú)夥治雒黠@改善,BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯減少,肺組織病理學(xué)改變明顯減輕,肺損傷評(píng)分、W/D比值、MPO活性明顯降低,提示上調(diào)miR-126能夠抑制ALI的炎癥反應(yīng),改善小鼠的肺組織損傷。

近期研究發(fā)現(xiàn),miR-126能夠通過靶向調(diào)控HMGB1抑制高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞[25]和視網(wǎng)膜細(xì)胞[26]的炎癥反應(yīng)。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)ALI小鼠肺組織中HMGB1蛋白的表達(dá)明顯升高。為了探索miR-126對(duì)ALI炎癥反應(yīng)的抑制作用是否與其對(duì)HMGB1的調(diào)控有關(guān),我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-126表達(dá)后,ALI小鼠肺組織HMGB1蛋白的表達(dá)明顯降低,提示上調(diào)miR-126對(duì)ALI小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與其對(duì)HMGB1的調(diào)控有關(guān)。HMGB1是一種進(jìn)化上高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,已經(jīng)被證實(shí)在致死性的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的作用。HMGBl刺激促炎細(xì)胞因子的釋放,反之,促炎細(xì)胞因子也能促進(jìn)HMGBl的釋放[27],形成了一個(gè)能夠放大炎癥反應(yīng)的正反饋環(huán)。Abraham等[28]發(fā)現(xiàn)直接在小鼠氣管內(nèi)注射HMGB1后會(huì)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞聚集,肺水腫及IL-1β、TNF-α和MIP-2分泌的增加。研究發(fā)現(xiàn),在內(nèi)毒素引起的ALI中,HMGB1激活NF-κB轉(zhuǎn)錄引起的炎性因子水平的增加,導(dǎo)致肺血管滲透性的增加[29,30],從而引起ARDS。特異性阻斷HMGB1可明顯減輕LPS引起的損傷,Gong等[31]證實(shí)了HMGB1拮抗劑通過減少促炎因子的產(chǎn)生,對(duì)LPS導(dǎo)致的ALI小鼠有顯著保護(hù)作用。

綜上所述,miR-126在ALI小鼠肺組織中呈現(xiàn)異常低表達(dá),上調(diào)miR-126能夠減輕ALI小鼠肺組織的炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與其對(duì)HMGB1的抑制有關(guān),為ALI的治療提供了新的研究方向。