SDF-1基因修飾的真皮多能干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷*

鮑全偉，宗兆文,，楊家治，葉 釗，呂明銳，譚 丹△

1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 急診科(重慶 400037)；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué) 衛(wèi)勤訓(xùn)練基地戰(zhàn)救技能培訓(xùn)教研室(重慶 400038)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是創(chuàng)傷中較為嚴(yán)重的損傷，常伴有較為嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的功能恢復(fù)。目前，對(duì)于SCI尚無有效的治療方案，干細(xì)胞移植被認(rèn)為是修復(fù)SCI功能損傷最有前景的方法之一[1-2]。研究[3]證實(shí)，脊髓中存在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)，并可參與SCI修復(fù)。如何增強(qiáng)內(nèi)源性NSCs的修復(fù)功能，成為SCI修復(fù)的策略之一。基質(zhì)源性因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)可刺激NSCs遷移，顯示出良好的運(yùn)用前景[3]，但如何局部高效運(yùn)用尚缺乏有效手段。本研究擬探討SDF-1基因修飾的大鼠真皮多能干細(xì)胞(dermal multipotent stem cells, dMSCs)移植后對(duì)SCI修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK(渝)20170004]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、尸體處理按照陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)SYXK軍2002032)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 主要試劑

pAdEasy腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建系統(tǒng)由本校解剖教研室董世武博士饋贈(zèng)，Tripure和DOTAP脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒購自瑞士Roche公司。細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶、血清等購自美國(guó)Hyclone公司。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購自美國(guó)Costar公司，3H-TdR購自中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所。兔抗SDF-1一抗、藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)和異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate, FITC)結(jié)合的二抗均購自美國(guó)Santa-Cruz公司。維甲酸、地塞米松、IBMX、胰島素、吲哚美辛購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，免疫組化試劑盒購自美國(guó)Boster公司。SDF-1 ELISA試劑盒購自德國(guó)Phoenix公司。

1.3 大鼠dMSCs的分離培養(yǎng)

采用前期建立的早期貼壁法分離dMSCs[4]。新生1 d Wistar大鼠，引頸處死，酒精消毒，剪取皮膚置于0.25%胰酶消化過夜。次日，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗后，去除表皮和皮下組織，將真皮組織剪成細(xì)胞碎片并吹打成細(xì)胞懸液，過濾后接種于培養(yǎng)瓶中。6 h后，棄培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)早期貼壁細(xì)胞。反復(fù)傳代至有集落樣細(xì)胞群體生成，按常規(guī)方法接種和選取細(xì)胞克隆，傳代備用。

1.4 Adv-SDF-1的構(gòu)建

采用前期建立的方法使用pAdEasy腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建Adv-SDF-1[4]。Tripure提取大鼠骨髓的總RNA，擴(kuò)增SDF-1的全長(zhǎng)cDNA，然后亞克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，再與pAdEasy-1質(zhì)粒在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組產(chǎn)生含有SDF-1的骨架質(zhì)粒。將驗(yàn)證正確的骨架質(zhì)粒用PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞，從而包裝出Adv-SDF-1。然后大量擴(kuò)增，空斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度后備用。

1.5 Adv-SDF-1感染dMSCs

向dMSCs 培養(yǎng)基中加入0.2 mL Adv-SDF-1病毒原液，病毒滴度約為2.0×1010PFU/mL，其中PFU為空斑形成單位(plaque-formating unit，PFU)。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，采用免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)SDF-1的表達(dá)。加入95%乙醇固定細(xì)胞20 min，PBS漂洗加入兔抗SDF-1，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，加入PE結(jié)合的熒光二抗，室溫孵育約30 min，PBS，漂洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole, DAPI)復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察。此外，按照SDF-1 ELISA試劑盒的說明檢測(cè)培養(yǎng)基中SDF-1濃度。

1.6 制備SCI模型及分組

采用改良Allen 重物打擊法制作SCI模型[5]。將麻醉的大鼠俯臥位固定后顯露T10節(jié)段的脊髓，用重20 g、打擊頭直徑為2.5 mm的打擊器自2.5 cm高度自由落下，造成T10節(jié)段脊髓打擊傷。將損傷后的成年大鼠36只隨機(jī)分為Adv-SDF-1感染dMSCs移植組(A組)，未感染dMSCs移植組(B組)，生理鹽水注射組(C組)，每組12只。收集Adv-SDF-1感染和未感染的dMSCs，將密度調(diào)整為1×107個(gè)/mL，A組大鼠用Hamilton注射器于損傷脊髓上、下各1 mm處注射100 μL Adv-SDF-1感染dMSCs，并保留注射器3 min防止細(xì)胞外漏；B組大鼠注射100 μL 未感染的dMSCs；C組大鼠注射100 μL生理鹽水。其中，病毒感染dMSCs的步驟同1.5。為防止膀胱感染，術(shù)后每日行人工擠壓膀胱排尿2 次。SCI 3、7 d后，取損傷處脊髓取材后4%甲醛固定，免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)損傷脊髓中央導(dǎo)水管及其附近的脊髓組織dMSCs的成活及分化情況，Nestin陽性細(xì)胞的分布情況。

1.7 行為學(xué)檢測(cè)

SCI 7 d后參照Ferguson等[6]Basso Beattie Bresnahan(BBB)評(píng)分法評(píng)定大鼠的功能恢復(fù)情況。觀察SCI大鼠早、中、晚期的后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分，總共分為21個(gè)等級(jí)，后肢全癱為0分，完全正常為21分。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Adv-SDF-1的構(gòu)建及其感染dMSCs后SDF-1表達(dá)的變化

因SDF-1在大鼠骨髓中高水平表達(dá)，故選擇從大鼠骨髓中提取RNA擴(kuò)增SDF-1，然后用pAd Easy腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了Adv-SDF-1。用其感染dMSCs后，可見dMSCs呈現(xiàn)綠色熒光，而細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變(圖1A)。免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)，Adv-SDF-1感染dMSCs后幾乎所有細(xì)胞均為SDF-1陽性(紅色熒光)，陽性細(xì)胞數(shù)量多于沒有感染的dMSCs(圖1B、C)。而酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試結(jié)果顯示，感染病毒載體的dMSCS培養(yǎng)基中SDF-1的濃度為(23.8±0.58) μg/L，明顯高于對(duì)照的(1.35±0.23 ) μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.235，P=0.006)。上述結(jié)果提示，Adv-SDF-1感染可上調(diào)dMSCs中SDF-1的表達(dá)水平，并可分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。

圖1 Adv-SDF-1感染dMSCs前、后SDF-1表達(dá)變化(100×)

2.2 Adv-SDF-1感染的dMSCs移植后dMSCs存活情況

SCI后3 d，可見SCI處DAPI標(biāo)記陽性dMSCs(圖2A)，傷后7 d陽性細(xì)胞數(shù)量增多(圖2B)，提示Adv-SDF-1感染的dMSCs移植后能夠正常存活并增殖。

圖2 Adv-SDF-1感染后dMSCs的存活情況(100×)

2.3 Adv-SDF-1感染后對(duì)Nestin陽性細(xì)胞的調(diào)動(dòng)及修復(fù)作用

3組大鼠功能評(píng)估結(jié)果顯示，移植細(xì)胞后7 d A組(6.70±0.52)分，高于B組(4.30±0.44)分及C組(4.10±0.48)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tA組VS B組=12.26，tA組VS C組=13.28，P<0.05)。

SCI后3 d，A組大鼠脊髓室管膜細(xì)胞Nestin陽性增加，SCI后7 d時(shí)其數(shù)量繼續(xù)增加，中央導(dǎo)水管周圍的脊髓組織內(nèi)有Nestin陽性細(xì)胞，提示其可能是室管膜細(xì)胞遷移至損傷組織。而B、C組大鼠SCI后3、7 d在中央導(dǎo)水管及其周圍的脊髓組織均未見到明顯的Nestin陽性細(xì)胞(圖3)。

圖3 移植后損傷脊髓中Nestin免疫熒光染色(200×)

3 討論

SCI指外界因素所致的脊髓受損，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域的感覺、運(yùn)動(dòng)信號(hào)的傳導(dǎo)改變，肌張力異常、出現(xiàn)病理反射，可表現(xiàn)為損傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重功能障礙，嚴(yán)重者可累及呼吸、泌尿等系統(tǒng)，甚至危及生命；SCI的治療方法有手術(shù)治療及非手術(shù)治療，手術(shù)治療主要在于手術(shù)解除壓迫、內(nèi)固定穩(wěn)定脊柱；非手術(shù)治療主要在于穩(wěn)定脊柱、避免并發(fā)癥及二次損傷，現(xiàn)有的治療策略主要為減少SCI后的繼發(fā)性損傷、應(yīng)用刺激神經(jīng)生長(zhǎng)的因子和(或)阻斷抑制軸突生長(zhǎng)的物質(zhì)促進(jìn)軸突的再生、組織或細(xì)胞移植重建損傷脊髓的解剖連接、修復(fù)損傷的髓鞘和恢復(fù)損傷區(qū)神經(jīng)纖維沖動(dòng)傳導(dǎo)以及促進(jìn)中樞神經(jīng)的可塑性變化[1-2]。現(xiàn)有的治療措施對(duì)于急性及陳舊性SCI具有一定臨床治療效果，但目前對(duì)于SCI后如何促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)尚無有效措施。

近年來, 隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展,應(yīng)用干細(xì)胞治療SCI的臨床研究日益增多。一般認(rèn)為，脊髓中的NSCs存在于軟膜表面的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞和位于中央管的室管膜細(xì)胞，且功能有可能不完全相同。目前，常用的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記有Nestin、Sox-2等，其中以Nestin最常用[7-9]，故在本研究中以Nestin 陽性的細(xì)胞來代表NSCs。SCI后脊髓白質(zhì)中Nestin 陽性的細(xì)胞可能來源于放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，而脊髓灰質(zhì)中Nestin 陽性的細(xì)胞可能來源于中央管的室管膜細(xì)胞[7-9]。

SCI發(fā)生后，Nestin 陽性細(xì)胞可遷移到損傷局部參與損傷修復(fù)，但其數(shù)量相對(duì)有限，如何更多的得到NSCs及使其遷移至損傷部位是本研究的重點(diǎn)。為了提高內(nèi)源性NSCs的修復(fù)效果，一些學(xué)者進(jìn)行了有益的探索。Fan等[7]發(fā)現(xiàn)，在SCI局部注射粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆刺激因子或移植樹突狀細(xì)胞可動(dòng)員脊髓內(nèi)源性NSCs參與損傷修復(fù)；Tashiro等[8]發(fā)現(xiàn)，SCI后功能鍛煉可增加損傷脊髓中Nestin陽性細(xì)胞的數(shù)量，并同功能恢復(fù)呈正相關(guān)；而Bambakidis等[9]證實(shí)，SCI局部注射或靜脈注射音猬因子后，可增加SCI局部?jī)?nèi)源性NSCs的數(shù)量。

研究[4,10-11]發(fā)現(xiàn)，SDF-1屬于CXC 族趨化性細(xì)胞因子，在脊髓等多種損傷組織局部上調(diào)表達(dá)，可趨化表達(dá)其受體CXCR4的干細(xì)胞到損傷局部參與損傷修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、dMSCs和NSCs等多種干細(xì)胞均表達(dá)SDF-1的唯一受體CXCR4。因此，設(shè)想在SCI局部高表達(dá)SDF-1進(jìn)而驅(qū)使脊髓本身NSCs向損傷局部遷移而達(dá)到脊髓修復(fù)的目的。由于具有取材方便、來源豐富、可進(jìn)行自體移植等特點(diǎn)，皮膚來源的干細(xì)胞移植具有神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等不具備的優(yōu)勢(shì)[12]。目前，已有多種類型的干細(xì)胞從皮膚中分離，如dMSCs、真皮纖維母細(xì)胞等[12]，dMSCs獲得較為方便，因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用dMSCs來進(jìn)行操作。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Adv-SDF-1感染dMSCs后SDF-1的表達(dá)明顯上調(diào)，再將Adv-SDF-1感染的dMSCs移植到大鼠SCI局部， SCI局部高表達(dá)SDF-1。SDF-1修飾的dMSCs移植后在SCI局部有更多的NSCs，BBB評(píng)分也顯示擁有更好的功能恢復(fù)。本研究?jī)H就SDF-1對(duì)Nestin陽性細(xì)胞的吸引進(jìn)行了初步觀察，但很多問題仍需要進(jìn)一步觀察，如基因轉(zhuǎn)染的安全性和致癌性問題等，將在以后的研究中對(duì)這些問題進(jìn)行深入探討。