分光光度法測(cè)定食品中亞硝酸鹽不確定度評(píng)估

◎ 陳銀珊

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 廣州 510670）

在日常生活中，由亞硝酸鹽引發(fā)的食物中毒事件及誘發(fā)致癌的報(bào)道常見諸于報(bào)端[1]。亞硝酸鹽是一種比較常見的食品添加劑，在肉制品生產(chǎn)中被廣泛使用，如常被用于醬鹵肉、西式火腿、腌臘肉等肉制品中，可增加肉類的鮮度，使產(chǎn)品色澤更加誘人，還可抑制微生物的生長(zhǎng)，由于亞硝酸鹽在肉制品生產(chǎn)中的無可替代性和功能性，導(dǎo)致肉制品中亞硝酸鹽的使用量超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[2-3]。而過量施用硝態(tài)氮肥的蔬菜[4-5]、酸菜等腌漬食品[6]、隔夜熟菜、霉變蔬菜、在不潔灶具中放置過久的食物以及火鍋食品中[7]，都含有較多的亞硝酸鹽。因此準(zhǔn)確檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的含量至關(guān)重要。

本文依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）第二法（分光光度法）檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的含量，并依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF1059.1—2012），分析探討食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)過程，對(duì)檢測(cè)過程中各個(gè)不確定度的來源進(jìn)行分析評(píng)定，計(jì)算食品中亞硝酸鹽檢測(cè)結(jié)果的不確定度[8]。

1 檢測(cè)方法

1.1 檢驗(yàn)依據(jù)

GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》第二法分光光度法。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

ML204/02 電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、UV-2550紫外可見分光光度計(jì)（島津公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

樣品條件：樣品經(jīng)充分粉碎后無異常現(xiàn)象；儀器條件：比色皿為1 cm，波長(zhǎng)為538 nm；環(huán)境條件：溫度為（25±5）℃，濕度為60%～80%。

1.4 檢測(cè)原理

在樣品提取液中加入硼酸飽和溶液調(diào)節(jié)pH 值為弱酸性，之后加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液，使蛋白質(zhì)沉淀，除去蛋白質(zhì)和脂肪后，加入對(duì)氨基苯磺酸與亞硝酸鹽重氮化，與加入的鹽酸萘乙二胺偶合產(chǎn)生紫紅色，于波長(zhǎng)538 nm 處測(cè)吸光度，利用外標(biāo)法測(cè)得亞硝酸鹽的含量。

2 數(shù)學(xué)模型

樣品中的亞硝酸鹽含量按式（1）計(jì)算。

式（1）中，X1-待測(cè)試樣中亞硝酸鹽的含量，單位為mg·kg-1；m1-待測(cè)樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量，單位為μg；M-樣品質(zhì)量，單位為g；V1-測(cè)定用樣液體積，單位為mL；V0-樣品處理液總體積，單位為mL；1 000-轉(zhuǎn)換系數(shù)。

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度各不確定度的來源

根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟分析，食品中亞硝酸鹽不確定度主要來源于：測(cè)量重復(fù)性、樣品稱量、樣品定容、測(cè)定用的樣液以及工作曲線。

4 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定

4.1 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度

6 次重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)見表1。

表1 重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)表

單次測(cè)量的不確定度（mg·kg-1）計(jì)算為：

（ω為亞硝酸鹽單次測(cè)量值）

標(biāo)準(zhǔn)不確定度（mg·kg-1）計(jì)算為：

測(cè)量結(jié)果的相對(duì)不確定度計(jì)算為：

4.2 樣品稱量引入的不確定度

由天平的檢定證書可知，天平的擴(kuò)展不確定度為U=0.2 mg，k=2，則樣品稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

則稱量5.000 0 g 樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

4.3 樣品定容引入的不確定度

4.3.1 由容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度

由200 mL 容量瓶的檢定證書可知，容量瓶的擴(kuò)展不確定度U=0.03 mL，k=2，則樣品定容至200 mL引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

4.3.2 由溫度引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)是在20 ℃的溫度條件下進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)室的溫度波動(dòng)為±5 ℃，20 ℃溫度下水的體積膨脹系數(shù)為2.07×10-3/℃，假定為均勻分布，則由溫度引入的不確定度計(jì)算為：

4.3.3 樣品定容引入的合成不確定度

樣品定容引入的合成不確定度計(jì)算為：

4.4 測(cè)定用樣液引入的不確定度

4.4.1 由移液器引入的不確定度

移取樣品液40 mL，即使用1 ～5 mL 移液器分8次移取，根據(jù)校準(zhǔn)證書可知，移液器的擴(kuò)展不確定度U=0.2%（5 mL），k=2，則吸取樣液體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

4.4.2 比色管定容引入的不確定度

由50 mL 比色管校準(zhǔn)證書可知，比色管的擴(kuò)展不確定度U=0.08 mL，k=2，則由其引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

4.4.3 測(cè)定用樣液引入的合成不確定度

實(shí)驗(yàn)過程中溫度不變，由4.3.2 可知溫度引入的不確定度μT=0.006 0，則測(cè)定用樣液引入的合成不確定度計(jì)算為：

4.5 工作曲線引入的不確定度

4.5.1 配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液引入的不確定度

（1）配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg·mL-1）引入的不確定度分為亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度、稱量0.100 0 g 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度以及500 mL 容量瓶引入的不確定度。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.99%±2.0%，假定為均勻分布，則由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度計(jì)算為：

稱量0.100 0 g亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度，稱量0.100 0 g 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度計(jì)算為：

500 mL 容量瓶引入的不確定度，已知U=0.20 mL，k=2，500 mL 容量瓶引入的不確定度計(jì)算為：

配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg·mL-1）的合成不確定度，實(shí)驗(yàn)過程中溫度不變，由4.3.2 可知溫度引入的不確定度μT=0.006 0，則配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg·mL-1）的合成不確定度計(jì)算為：

（2）吸取2.5 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度。已知U=0.2%（2.5 mL），k=2，則吸取2.5 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度計(jì)算為：

（3）100 mL容量瓶引入的不確定度。已知U=0.05 mL，k=2，則100 mL 容量瓶引入的不確定度計(jì)算為：

（4）配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0 μg·mL-1）的合成不確定度。實(shí)驗(yàn)過程中溫度不變，由4.3.2 可知溫度引入的不確定度μT=0.006 0，則配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0 μg·mL-1）的合成不確定度計(jì)算為：

4.5.2 擬合工作曲線引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的9 個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)測(cè)1 次，一共有9 個(gè)測(cè)試點(diǎn)。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.015 49x–0.000 58，R2=0.999 93。當(dāng)x取值xi時(shí)，由回歸方程y=bx+a計(jì)算得到的y的估計(jì)值為yj，即yj=a+bxi，測(cè)量值yi與估計(jì)值yj的殘差反映了回歸方程的精密度。具體數(shù)據(jù)如表2 所示。

表2 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表

回歸方程的剩余標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算為：

測(cè)定樣品液6 次，測(cè)得樣品液中亞硝酸鹽含量的平均值為x0=11.2 mg·kg-1，則標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)帶來的相對(duì)不確定度計(jì)算為：

4.5.3 紫外可見分光光度計(jì)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由UV-2550 紫外可見分光光度計(jì)的檢定證書可知，透射比的擴(kuò)展不確定度為Uts=0.3%，k=2，波長(zhǎng)的擴(kuò)展不確定度為Ubc=0.3 nm，k=2，用同一個(gè)波長(zhǎng)測(cè)量，波長(zhǎng)的不確定度可以不計(jì)入。則由紫外可見分光光度計(jì)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

4.5.4 由工作曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由工作曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

4.6 合成不確定度

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（mg·kg-1）：

擴(kuò)展不確定度：

當(dāng)k=2 時(shí)，則分光光度法測(cè)定食品中亞硝酸鹽的擴(kuò)展不確定度（mg·kg-1）計(jì)算為：U=0.35×2=0.70。

5 結(jié)論

取包含因子為2，則食品中亞硝酸鹽含量的擴(kuò)展不確定度為0.70，由本文中亞硝酸鹽的測(cè)定結(jié)果可知亞硝酸鹽的含量平均值為11.2 mg·kg-1，根據(jù)該實(shí)驗(yàn)的評(píng)定，食品中亞硝酸鹽的測(cè)定結(jié)果可以表示為X=（11.2±0.70）mg·kg-1，k=2。