系統調控下棉花比葉重的變化機制

孟浩峰，雷長英，張旺鋒，張亞黎

（石河子大學農學院/ 新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室, 新疆石河子832003）

比葉重（Leaf mass per area，LMA）是反映葉片功能的性狀之一。 比葉重與葉片的諸多生理反應有聯系，并且能夠反映單位葉面積光合產物的積累[1-2]。 研究表明，比葉重的變化是葉片對資源利用率和環境適應性的表現[3-4]。 近年來，比葉重的相關研究是植物生理生態學家和農學家關注的焦點。 有關全球葉片經濟譜的研究表明，比葉重與葉片單位質量的最大光合速率、葉片發育狀況和葉片年齡等均有較好的相關性[4]。 同時，Osnas 等[5]也指出比葉重是葉片經濟譜功能性狀關系網絡中的核心指標，葉片經濟譜和比葉重的關系能夠說明植物性狀的生理生態學功能間的內在聯系。 許多研究發現，葉片可以通過改變比葉重和解剖結構性狀來適應不同的光環境[6-11]。Witkowski 和Lamont[12]的研究表明，植物比葉重的變化主要受葉片厚度和葉片密度的影響，它們的變化也會影響光合速率和光能利用率[13]。 當光環境變化時，植物葉片可以通過調節比葉重來優化光合速率和光能利用率，從而在資源利用率和環境適應性之間達到新的平衡[2,14]。 因此，研究不同光環境下比葉重和其他組織結構性狀的變化規律，對豐富和完善葉片功能性狀與經濟譜之間的平衡關系具有重要意義。

光是影響葉片生長發育的重要環境因素之一。 自然環境下，植物不同部位葉片受到的光強差異明顯，光強的差異會影響葉片形態解剖結構和生理代謝過程，最終對植物的生長發育產生影響。 許多學者通過研究光強變化對葉片形態解剖結構的影響，揭示了植物葉片對不同光環境的適應機制。 一般情況下，低光下生長的植株葉片面積增大、比葉重降低、葉片厚度減小、柵欄組織厚度降低；雖然葉片的葉綠素含量升高，但是葉綠體發育受影響，最終光合能力降低，限制植物的光合生產能力[15-17]。 同時，光會以信號因子的方式影響植物葉片的形態和功能， 即光形態建成。Karpinski 等[18]首次提出擬南芥的葉片間存在對過剩光能信號的系統調控。 隨后，Lake 等[19]、Thomas 等[20]、Jiang 等[21]和Li 等[22-23]的研究證明在室內和田間不同光環境下，植物不同部位葉片的結構和光合性能之間存在系統調控作用。 同時，植物葉片對光環境的適應性除了與其形態解剖結構有關，也受葉片發育狀態的影響。 目前關于比葉重和葉片結構的研究，主要是關注植株處于同一環境中對光強的適應性，忽視了對不同部位葉片處于異質性光環境下比葉重和葉片結構適應性的研究。 基于此，本研究擬通過田間密度試驗和室內遮蔭試驗，探討以下問題：(1)棉花不同部位葉片比葉重的變化及葉片之間的系統調控作用；(2)在異質性光環境下，棉花不同部位葉片的組織結構性狀如何影響比葉重的變化。

1 材料和方法

1.1 田間試驗

試驗在新疆沙灣縣烏蘭烏蘇農業氣象試驗站（44°17'N，85°49'E）進行，供試棉花品種為新陸早45 號。 在大田條件下，設置低和高2 個種植密度（行距均為（60＋20） cm，株距分別為29.6 cm和7 cm）：7.5 萬株·hm－2和31.5 萬株·hm－2。采用完全隨機設計，每個處理6 個重復。 小區長6 m，寬5.6 m（4 條膜，1 膜4 行），面積33.6 m2。試驗期間氣象數據見圖1。

試驗地土壤為壤土， 播前深施有機肥1 500 kg·hm－2， 氮素240 kg·hm－2， 三料磷肥80 kg·hm－2作基肥， 全生育期隨水滴施氮素260 kg·hm－2；化控6 次，縮節胺總用量230 g·hm－2，其他田間管理措施同膜下滴灌高產棉田。 在棉花盛花期（播種后85～90 d）挑選生長發育狀況大致相同的棉株，對第二和第八果枝主莖葉片做標記，2周后進行各項指標的測定。2016 年棉花生長期（4月1 日―10 月31 日） 的溫度和降水量變化如圖1 所示。 測量了高密度下棉花上部和下部葉片的光合有效輻射（Photosynthetically active radiation，PAR），與上部葉片相比，下部葉片受到的光強降低70%。 并基于此，設計了室內遮蔭模擬試驗的遮蔭程度。

圖1 田間試驗期間的最高氣溫、最低氣溫和降水量(2016 年)Fig. 1 Daily maximum temperature, daily minimum temperature and precipitation in field experiment (2016)

1.2 室內試驗

供試棉花品種為新陸早45 號， 在石河子大學綠洲生態農業重點實驗室頂置光照型人工氣候室（南京恒裕儀器設備制造有限公司）內進行盆栽試驗。 頂置光照型人工氣候室內棉花生長期間葉片受到的光強約為1 000 μmol·m－2·s－1。 盆栽試驗棉花的播種灌水方式與基質絕對含水量測定方法參考孟浩峰等[24]研究。 當棉花生長至盛花期時，挑選生長發育狀況大致相同的棉株掛葉標記，用遮蔭裝置進行遮蔭處理2 周。

試驗設置3 個處理：不遮蔭（CK）、中下部葉片遮蔭（MS）、整株遮蔭（S）（圖2）。植株不進行遮蔭處理（最大光強保持在1 000 μmol·m－2·s－1），作為對照；中下部葉片遮蔭處理的植株將其倒二葉以下用遮蔭裝置遮住 （最大光強保持在300 μmol·m－2·s－1）； 整株遮蔭處理用遮蔭裝置將整個植株全部遮住。 遮蔭處理的葉片均處于遮光70%的環境中。葉片遮蔭處理2 周后，開始測定試驗相關指標。 以上每個處理設6 個重復。

圖2 盆栽試驗遮蔭處理Fig. 2 Shading treatment of pot experiment

1.3 測定項目及方法

1.3.1 比葉重。 選取各處理上部和下部葉片，用打孔器在除葉片主葉脈的位置上隨機取5 個圓形葉片樣品，裝入牛皮紙袋，放入烘箱80 ℃下烘干48 h 后， 用電子天平進行稱重， 計算比葉重：LMA＝葉片干物質質量/葉片面積。

1.3.2 葉片解剖結構。 選取各處理上部和下部葉片，用刀片在靠近主脈基部1/3 處切取葉片樣品，迅速放入FAA 固定液中保存24 h， 待葉片被固定液完全浸沒， 取出用不同濃度的乙醇進行脫水，然后高溫浸蠟包埋，最后用切片機（Leica RM 2235，USA）切片，厚度為5 μm，脫蠟后用番紅固綠進行染色， 在熒光顯微鏡 （Olympus BX51，Japan）下進行解剖結構的拍照。用ImageJ 軟件測量照片中的葉片厚度（Leaf thickness，LT）、柵欄組織厚度（Palisade tissue thickness，PT）和海綿組織厚度（Spongy tissue thickness，ST）。計算葉片結構緊密度（Cell tense ratio，CTR）和葉片結構疏松度（Spongy ratio，SR）：

CTR＝（PT/LT）×100%；

SR＝（ST/LT）×100%.

1.3.3 葉片密度（Leaf density，LD）。 葉片密度指單位葉體積的干物質的質量。 比葉重可以用葉片密度和葉片厚度的乘積來表示[12]。因此，根據測定的各處理上部和下部葉片的比葉重和葉片厚度可以計算其葉片密度，即：LD＝LMA/LT。

1.3.4 組織結構性狀對比葉重變化的影響。 通過線性回歸確定形態（比葉重、葉片厚度和葉片密度）與解剖特征（柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片結構緊密度和葉片結構疏松度）之間的關系。根據de la Riva 等[25]平方和（Sum of squares，SS）分解的方法，總的平方和（SS總計）可以分解為由線性回歸分析模型的每個預測變量的平方和（SS回歸）和無法解釋的變量的平方和（SS殘差）。 因此：

SS總計＝SS回歸＋SS殘差.

LMA 與LD 和LT 進行線性回歸得到SS（LD,LT）（LMA 與LD 和LT 進行線性回歸得到的SS回歸）。LMA 與LT 或LD 分別進行線性回歸得到SSLT和SSLD（SSLT是用LMA 與LT 進行線性回歸得到的SS回歸，SSLD是用LMA 與LD 進行線性回歸得到的SS回歸）。 由于LT 和LD 之間存在相關性，SSLT＋SSLD將高于SS（LD,LT），為了避免LT 和LD 共同影響的SS回歸， 重新計算LT、LD 單獨影響的SS’回歸，即SS’LD＝SS（LD,LT）－SSLT，SS’LT＝SS（LD,LT）－SSLD，最后計算由LT 或LD 影響LMA 變化的百分比：LD（%）＝（SS’LD/SS總計）×100；LT（%）＝（SS’LT/ SS總計）×100。 組織結構對葉片厚度和葉片密度變化的影響也用此方法進行計算，具體計算方法及步驟見附表1～5。

1.3.5 數據統計

用SPSS 18.0 對數據進行方差分析和線性回歸分析。田間試驗采用獨立樣本t 檢驗，分析數據差異顯著性（顯著，P＜0.05；極顯著，P＜0.01）；室內試驗采用單因素方差分析，分析數據差異顯著性（顯著，P＜0.05；極顯著，P＜0.01），并用Duncan 新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 棉花上部和下部葉片比葉重的變化

田間密度試驗表明，高密度處理的棉花上部和下部葉片的比葉重均顯著低于低密度處理，且同一密度處理的下部葉片的比葉重均顯著低于上部葉片（圖3）。室內遮蔭試驗結果表明，與未遮蔭處理相比，中下部葉片遮蔭處理后，其上部和下部葉片的比葉重均顯著降低，與整株遮蔭處理無顯著差異，且同一遮蔭處理的上部和下部葉片的比葉重無顯著差異（圖3）。

2.2 棉花上部和下部葉片組織結構性狀的變化及與比葉重的相關性

田間密度和室內遮蔭試驗的葉片解剖結構見圖4。組織結構性狀量化計算的結果表明，隨著種植密度和遮蔭程度的增加，棉花上部和下部葉片的比葉重、葉片厚度、柵欄組織厚度和葉片結構緊密度均逐漸降低，葉片結構疏松度均逐漸升高，海綿組織厚度無顯著變化。 但是，葉片密度的變化趨勢相反（圖5）。

由圖6 可知，不同種植密度下，棉花上部和下部葉片的比葉重與葉片厚度、 柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉片結構緊密度均呈極顯著正相關（P＜0.01），與葉片結構疏松度呈極顯著負相關（P＜0.01）；棉花上部和下部葉片的葉片厚度與柵欄組織厚度和葉片結構緊密度均呈極顯著正相關（P＜0.01），與葉片結構疏松度呈極顯著負相關（P＜0.01）；棉花上部和下部葉片的葉片密度與柵欄組織厚度和葉片結構緊密度均呈極顯著負相關（P＜0.01），與葉片結構疏松度呈極顯著正相關（P＜0.01）。 不同遮蔭條件下，棉花上部和下部葉片的比葉重與葉片密度、葉片厚度、柵欄組織厚度和葉片結構緊密度呈極顯著正相關 （P＜0.01）， 與葉片結構疏松度呈極顯著負相關（P＜0.01）；棉花上部和下部葉片的葉片厚度與柵欄組織厚度呈極顯著正相關（P＜0.01），與葉片結構疏松度呈極顯著負相關（P＜0.01）；棉花上部葉片的葉片密度與海綿組織厚度呈顯著正相關 （P＜0.05），棉花下部葉片的葉片密度與柵欄組織厚度和葉片結構緊密度呈極顯著正相關（P＜0.01），與海綿組織厚度和葉片結構疏松度呈顯著或極顯著負相關（P＜0.05；P＜0.01）。

圖3 不同種植密度和不同遮蔭條件下棉花上部和下部葉片比葉重的變化Fig. 3 Changes of leaf mass per area in top and lower leaves of cotton under different planting densities and different shading treatments

圖4 不同種植密度和不同遮蔭條件下棉花上部和下部葉片的解剖結構圖Fig. 4 Anatomical structure of top and lower leaves in cotton under different planting densities and different shading treatments

2.3 棉花上部和下部葉片組織結構性狀對比葉重變化的影響

將線性回歸得到的平方和進行比值，計算組織結構性狀影響比葉重、葉片厚度和葉片密度變化的百分比。 結果表明，不同種植密度下，棉花上部葉片比葉重變化的77.69%受到葉片厚度的影響，葉片厚度變化的62.33%受到柵欄組織厚度的影響，葉片密度變化的36.36%受到葉片結構疏松度的影響；棉花下部葉片比葉重變化的45.45%受到葉片厚度的影響，葉片厚度變化的70.16%受到柵欄組織厚度的影響，葉片密度變化的20.00%受到葉片結構疏松度的影響。 不同遮蔭條件下，棉花上部葉片比葉重變化的32.85%受到葉片厚度的影響，葉片厚度變化的58.97%受到柵欄組織厚度的影響，葉片密度變化的11.11%受到葉片結構緊密度的影響； 棉花下部葉片比葉重變化的34.29%受到葉片密度的影響， 葉片厚度變化的22.06%受到柵欄組織厚度的影響，葉片密度變化的19.23%受到葉片結構緊密度的影響（圖7）。

圖5 不同種植密度和不同遮蔭條件下棉花上部和下部葉片的比葉重與組織結構性狀的相關性Fig. 5 Correlation of leaf mass per area and tissue structure character of top and lower leaves in cotton under different planting densities and different shading treatments

圖6 不同種植密度和不同遮蔭條件下棉花上部和下部葉片的形態結構（灰色）和解剖結構（綠色）與比葉重（黃色）的相關網絡Fig. 6 Correlation network for morphological (grey), anatomical (green) and LMA (yellow) of top and lower leaves in cotton under different planting densities and different shading treatments

3 討論

3.1 棉花上部葉片比葉重的變化受到下部葉片系統調控的影響

比葉重的變化不但能夠反映單位葉面積光合產物的積累，而且能反映植物葉片對資源的利用率和對環境的適應性[3,4,14,25-26]。 本研究表明，棉花上部葉片比葉重的變化除了與其自身所處的光環境有關，還受到下部葉片光環境的影響（圖3）。 前人研究表明，不同光環境下的上部和下部葉片之間存在長距離的系統信號調控[19,21,27]。因此推斷， 系統光信號通過調控棉花葉片的發育過程，進而影響比葉重的變化。 相較室內遮蔭試驗，田間密度試驗受外界環境因素的影響較大，上部葉片比葉重的變化除了受到系統調控的影響之外，可能更多受到環境的影響，而且田間不同部位葉片的光照環境具有動態波動性，調控因素會更為復雜。 室內遮蔭試驗的環境因素和受光條件保持相對的穩定，上部葉片比葉重的變化主要受到系統調控的強烈影響，上部葉片比葉重下降的幅度要高于田間密度試驗。 因此，室內遮蔭試驗和田間密度試驗的棉花上部和下部葉片比葉重的變化幅度存在差異。

3.2 系統調控下棉花葉片比葉重的變化主要受到柵欄組織厚度的影響

比葉重受到葉片厚度和葉片密度等的影響[12-13]。 葉片厚度受柵欄細胞的層數和長度影響，受光環境調控[29-31]。 葉片密度受細胞壁厚度、細胞大小和細胞間隙影響，主要取決于細胞的膨大和分化速率[12]。 相關研究表明，隨光強的變化，葉片密度和葉片厚度在比葉重的變化中均扮演重要角色[6-8]。

圖7 不同種植密度和不同遮蔭條件下棉花上部和下部葉片的組織結構性狀對葉片厚度、葉片密度和比葉重變化的影響Fig. 7 Effect of tissue structure character on the variation of LT, LD and LMA in cotton under different planting densities and different shading treatments

前人研究表明，比葉重與葉片解剖結構性狀（葉片密度和葉片厚度）有很強的相關性[1,25-26]。 本研究的田間密度試驗表明，棉花上部和下部葉片比葉重的變化主要受葉片厚度 （77.69%和45.45%）的影響（圖7）。 與Coble 和Cavaleri[28]報道的有關光和高度影響下葉片結構性狀對比葉重影響的研究結果并不一致，可能與物種和試驗條件不同有關。 室內遮蔭試驗表明，棉花上部和下部葉片的比葉重受到葉片厚度和葉片密度的影響， 其中上部葉片比葉重的變化受葉片密度（22.50%）和葉片厚度（32.85%）共同影響，下部葉片比葉重的變化受葉片密度（34.29%）和葉片厚度（4.59%）的共同影響（圖7）。田間密度試驗與室內遮蔭試驗中棉花上部和下部葉片的葉片密度與比葉重和組織結構性狀的相關性存在差異，與田間和室內環境因素、受光條件和棉花生長情況的差異有關。 因此，在系統調控下，棉花上部和下部葉片比葉重的變化主要受到葉片厚度的影響。有研究表明， 弱光環境下生長的葉片比葉重較低，比葉重的降低與葉片厚度、柵欄組織厚度和葉片密度的顯著降低有關[6,25,31]。 通過分析組成葉片厚度和葉片密度的組織結構性狀的變化，發現不同密度條件下，棉花上部和下部葉片厚度的變化主要受柵欄組織厚度（62.33%和70.16%）的影響。 不同遮蔭條件下，棉花上部和下部葉片厚度的變化也主要受柵欄組織厚度 （58.97%和22.06%）的影響（圖7）。 進一步證明，在系統調控下，棉花上部和下部葉片比葉重的變化主要受柵欄組織厚度的影響。

3.3 棉花比葉重的變化系統調控模式與機制

研究種間、種內的葉片厚度和葉片密度對比葉重變化的貢獻在植物生理生態和農學研究中具有重要意義[1,25-26]。 本研究表明，棉花同一植株不同部位葉片間比葉重的變化存在系統調控作用（圖3）。 有研究表明，隨著光強的升高，比葉重顯著增加，這與葉片厚度和柵欄組織厚度的增加有關[30]。本研究結果表明，光主要影響柵欄組織厚度的變化，而柵欄組織厚度又影響不同部位葉片比葉重的變化，這與Coble 和Cavaleri[8]關于冠層中的垂直光梯度影響柵欄組織厚度和比葉重的研究結果一致。 對于同一種植物，光強降低雖然會使葉片的比葉重、厚度、柵欄組織厚度和密度下降，但會導致葉片面積顯著增加，增大葉片捕光面積，以適應弱光環境[7-8,32-33]。 在系統調控下，一方面， 棉花上部和下部葉片的比葉重降低，柵欄組織厚度降低，葉片變薄（圖5），葉綠體對光的吸收能力進一步增強， 以適應異質性光環境，保證光合系統的正常運轉[11,34]；另一方面，棉花上部和下部葉片組織的緊實度降低，組織的疏松度增加（圖5），而這樣的改變可能會提高光的透射和反射能力， 在保護自身免受強光傷害的同時，提高了光能利用效率[11]。 這是上部和下部葉片在系統調控作用下適應異質性光環境的表現。

雖然本研究證實了棉花上部葉片比葉重的變化受到下部葉片所處光環境的系統調控，但影響棉花上部和下部葉片比葉重變化的解剖結構因素并不完全一致。 不同密度條件下，棉花上部和下部葉片的比葉重受到柵欄組織厚度的影響，不同遮蔭條件下，棉花上部和下部葉片的比葉重受到柵欄組織厚度和葉片密度的共同影響 （圖6～7）。 因此，不同部位葉片對異質性光環境的適應性有其獨特的系統調控網絡。 本研究表明，密植條件下，棉花上部和下部葉片比葉重分別降低了16.64%和13.61%；遮蔭條件下，棉花上部和下部葉片比葉重分別降低了35.64%和42.71%（圖3）。 所以在研究比葉重與葉片經濟譜的關系時，除了要考慮不同生態環境的影響，還應考慮葉片不同發育狀態以及葉片間系統調控作用的潛在影響。 在農業生產中，可以通過適當調整種植密度來控制中下部葉片之間的相互遮蔭，這樣既可以提高其自身的碳同化能力，也有利于上部葉片的生長發育和光合能力的提高，最終提高群體的光能利用效率，獲得高產。

4 結論

棉花上部葉片比葉重的變化受下部葉片所處光環境的系統調控；在系統調控下棉花葉片比葉重的變化主要受柵欄組織厚度的影響。

附表：

附表詳細內容參見http://journal.cricaas.com.cn/

附表1 LMA 與LT 和LD 進行線性回歸的結果

Table S1 The results of linear regression between LMA and LT,LD

附表2 LMA 與LT 進行線性回歸的結果

Table S2 The results of linear regression between LMA and LT

附表3 LMA 與LD 進行線性回歸的結果

Table S3 The results of linear regression between LMA and LD

附表4 LMA 不同回歸分析的平方和分解：A)LMA與LT 和LD 進行線性回歸的結果B)LMA 與LT 進行線性回歸的結果C)LMA 與LD 進行線性回歸的結果

Table S4 Decomposition of sum of squares in different regression analysis of LMA: A) The results of linear regression between LMA and LT,LD;B)The results of linear regression between LMA and LT;C)The results of linear regression between LMA and LD

附表5 LT 和LD 對LMA 變化的影響

Table S5 Effect of LT and LD on the variation of LMA