馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯抑制HepG2 細胞的增殖研究

劉詩穎，何坤燕，李英華，朱 冰，諶素華 ，秦小明 ，鐘賽意 ，高加龍 ， 陳建平

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東湛江 524088；2. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學，遼寧大連 116034；3. 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心中心實驗室，廣東廣州 510120；4. 廣東海洋大學深圳研究院，廣東深圳 518108）

0 引言

在我國，癌癥問題變得日益突出，每7～8 個人中就有1 人死于癌癥。當前，治療癌癥的手段主要有手術、放療和化療3 種，然而由于存在藥物的耐藥性等問題導致治療效果不理想，治愈率較低。因此，從自然界中篩選天然高效無毒的抗腫瘤藥物成為目前的研究熱點。

馬尾藻是一種產自中國廣東、海南等地的褐藻，其資源豐富[1]。據(jù)統(tǒng)計，全國共有130 種馬尾藻屬[2]，其中23 種在廣東沿海海域分布較多[3]。近年來，研究報道馬尾藻中富含具有多種生物活性的巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan）[4-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，馬尾藻是一種廣泛存在于褐藻及海洋無脊椎動物當中的含硫酸基的雜聚糖[8-9]。相關研究人員從Focus vesiculosus 中提取得到巖藻聚糖，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制脂質的積累[10]。課題組前期在馬尾藻多糖方面開展了系列研究，研究表明馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂具有較好的抗氧化和降血脂效果[11-16]。然而，關于其抗腫瘤活性的研究報道較少。故選擇HepG2 細胞作為研究對象，采用MTT方法、流式細胞術和檢測ROS 含量考查馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯抑制HepG2 細胞增殖的能力，為馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯在抗腫瘤臨床藥物的應用開發(fā)中提供新的科學依據(jù)和技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂，實驗室自制；人肝癌HepG2 細胞，美國ATCC 細胞庫提供；正常人肝LO2 細胞，中國科學院（上海） 細胞庫提供；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco 公司提供；噻唑藍（MTT），美國Hyclone 公司提供；細胞周期檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司提供；活性氧檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司提供。其他試劑（分析純），國藥集團提供。

1.2 儀器與設備

BP301S 型電子天平，德國Sartorius 公司產品；Versamax 酶標儀，美國Molecular Devices 公司產品；FACS Aria 流式細胞儀，美國Waters 公司產品。

1.3 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂的提取

參考劉海韻等人[17]的方法提取馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂。取適量馬尾藻粉，按1∶30（g∶mL） 料液比加入蒸餾水，采用超聲波輔助水提法，經離心、濃縮后，脫除褐藻膠、脂肪，真空冷凍干燥后獲得粗提物。加蒸餾水150 mL 溶解2 g 的粗提物，然后加Sevage 試劑，經離心、透析后，真空冷凍干燥得到粗多糖。最后，用0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaCl 溶液活化DEAE-52 纖維素，將活化后的DEAE-52 纖維素裝入層析柱后，用1.0 mol/L NaCl 溶液對粗多糖溶液進行洗脫，對應洗脫出的組分即為純化后的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂。

1.4 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和50 U/mL 鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)液中。細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2），根據(jù)細胞生長情況進行傳代，取對數(shù)期細胞進行試驗。

1.5 MTT 檢測馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂抑制HepG2 和LO2 細胞生長的效果

將細胞密度為 2×104、5×104個細胞 / 孔的HepG2 細胞和LO2 細胞接種于96 孔板，放入37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂100 μL 處理細胞24 h 后，往96孔板中加入5 mg/mL MTT，每孔20 μL，置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2） 中孵育4 h，用移液器移去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，經搖床振蕩10 min后，使用酶標儀（SpectaMax 250） 測定各孔在570 nm 處的光密度（OD） 值。以空白對照組的OD 值為100%，計算細胞存活率。

細胞存活率的計算見公式（1）：

式中：Ai——不同處理組OD 值；

A0——空白對照組OD 值。

1.6 流式細胞儀分析馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 細胞生長周期的影響

取對數(shù)期生長的腫瘤細胞，以2×104cell/mL 細胞密度鋪6 cm 培養(yǎng)皿，24 h 后分別按如下方式進行加藥處理。其中，對照組不加藥；馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯組加入不同濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯[18]。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間。用PBS 清洗2～3 次后用胰酶消化，然后收集細胞。參考細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作，用PBS 洗滌細胞一次（以轉速2 000 r/min 離心5 min） 收集并調整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL 單細胞懸液，離心后，去除上清液，在細胞中加入70%冰乙醇500 μL 固定，置于-20 ℃冰箱中過夜。以轉速1 000 r/min 離心3 min 去掉冰已醇，加入500 μL PI/RNase A 染色工作液，室溫避光30 min 后上機待測。每個樣品至少分析10 000 個細胞。

1.7 ROS 含量檢測

取對數(shù)生長期的腫瘤細胞置于6 孔板上預培養(yǎng)24 h，分別按如下方式進行加藥處理。其中，對照組不加藥；馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯組加入不同濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后，參考活性氧檢測試劑盒說明書進行操作。在37 ℃下，用10 μmol/L DCFH-DA 孵育細胞20 min，細胞經無血清培養(yǎng)基洗滌后，用PBS 重懸細胞，然后在熒光酶標儀下檢測各組的熒光強度值變化。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 細胞存活率的影響

采用MTT 方法評價馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對人肝癌HepG2 細胞存活率的影響，以正常肝LO2 細胞做對照。

不同質量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 和LO2 細胞存活率的影響見圖1。

圖1 不同質量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 和LO2 細胞存活率的影響

由圖1 可知，在馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂質量濃度為0.5～4.0 mg/mL 內，隨著質量濃度的升高，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 細胞和LO2 的存活率呈逐漸降低趨勢，分別從88.78±0.05（0.5 mg/mL）、95.85±0.01（0.5 mg/mL） 降低到 43.94±0.07（4 mg/mL）、74.46±0.04（4 mg/mL），這表明馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 細胞的抑制活性要強于正常肝LO2 細胞，表明具有較好的細胞選擇性。當馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂的質量濃度達到8 mg/mL 時，其對HepG2細胞和LO2 的存活率分別達到最大為11.61±0.002和25.11±0.001，研究表明馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂在較高質量時，對正常細胞也會造成巨大的損傷。故后續(xù)試驗質量濃度選擇在0.5～4.0 mg/mL 以內。

2.2 不同質量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2細胞生長周期的影響

采用1，4 mg/mL 的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂作用于HepG2 細胞24 h 后，運用流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡情況。

馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂在不同質量濃度下對HepG2 細胞周期的影響見圖2。

圖2 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂在不同質量濃度下對HepG2 細胞周期的影響

由圖2 可知，經1，4 mg/mL 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理后的HepG2 細胞凋亡率SubG1 峰從空白對照組的2.14%分別提高到16.6%和19.37%，且處于G0/G1 期的細胞從空白對照組的39.80%分別提高到53.73%和61.42%，上述試驗結果表明，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂通過誘導細胞凋亡和G0/G1 期細胞周期阻滯來抑制細胞的增殖。

2.3 不同質量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對細胞內ROS 含量的影響

1，2，4 mg/mL 的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對ROS含量的影響。

不同質量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對細胞內ROS 含量的影響見圖3。

由圖3 可知，在5 min 內，相比空白處理組，1，2，4 mg/mL 馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理細胞后，細胞內ROS 含量明顯升高，分別從100%提高到364.16%，489.98%，560.87%，隨著處理時間的延長，ROS 含量均呈下降趨勢，到60 min 之后這種下降趨勢變得較平緩，這可能是由于細胞在受到馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂刺激后，短時間細胞內產生大量的活性氧（ROS），隨著處理時間的延長，細胞內的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮作用清除細胞內的ROS，導致ROS 含量呈下降趨勢，由于ROS 過多，無法完全清除，最終導致ROS 含量下降趨勢變得較平緩。

圖3 不同質量濃度的馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對細胞內ROS 含量的影響

3 結論

運用MTT 測定了馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 肝癌細胞存活率的影響，并運用流式細胞儀和檢測細胞內ROS 含量初步探究馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂抑制HepG2 增殖的機理。得到的結論如下：

（1） 經馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理HepG2 細胞24 h 后，能顯著降低細胞的存活率，在測試質量濃度內，細胞存活率最低達到11.61%±0.002%，上述結果表明，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂對HepG2 肝癌細胞具有較強的抑制效果。

（2） 經流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞經馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理24 h 后，能顯著提高凋亡細胞數(shù)目和G0/G1 期的細胞數(shù)目，進一步檢測細胞內ROS 含量發(fā)現(xiàn)，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂處理細胞后能夠提高細胞內ROS 的含量，上述結果表明，馬尾藻巖藻聚糖硫酸脂通過誘導細胞內ROS的產生導致細胞發(fā)生凋亡和G0/G1 期阻滯,從而抑制HepG2 細胞的增殖。