Bex1和NF?kBp65在舌鱗狀細胞癌組織中的表達及意義

王倩倩， 丁丹丹， 丁翔， 韓瑞， 韓影影， 周美云， 徐錦程

1. 蚌埠醫學院第一附屬醫院口腔科，安徽 蚌埠（233004）； 2. 蚌埠醫學院第二附屬醫院口腔科，安徽 蚌埠（233000）

舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔鱗狀細胞癌中最常見的類型，男性多于女性，但近年來有女性發病增多及發病年齡年輕化的趨勢［1］。雖然TSCC 的診斷和治療水平有所提高，但其預后仍較差，且局部浸潤和遠處轉移是TSCC 患者預后較差的主要原因［2］。核因子?kB（nuclear factor kappa B，NF?kB）是真核細胞中一種重要的核轉錄因子，以p65/p50二聚體為中心的NF?kB 異常活化在腫瘤形成、侵襲和轉移及抗凋亡機制中發揮重要作用［3?4］。腦表達的X 連鎖基因1（brain expressed X?linked gene 1，Bex1）是Bex 家族的成員，近年來有研究發現Bex 參與細胞周期調控、細胞凋亡等重要的病理生理過程及一些癌癥的發生發展過程。Lee 等［5］曾報道Bex1 在口腔鱗狀細胞癌中表達下調，但Bex1 和NF?kB 與TSCC 臨床病理特征和預后關系的研究較少。本文采用免疫組化法檢測Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中的表達情況，并進一步探討其與臨床病理特征及預后的關系，以期為TSCC 的診斷和治療提供有價值的參考。

1 資料和方法

1.1 基本資料

收集蚌埠醫學院第一附屬醫院口腔科2012 年1 月至2014 年12 月經手術切除且病理證實為TSCC 的保持完整的石蠟組織標本60 例。所有患者術前均未行放、化療，術后病理證實有淋巴結轉移者轉至放療科放療等。年齡36～82 歲，中位年齡62 歲，男性41 例，女性19 例。高分化者33 例，中分化15 例，低分化12 例。腫瘤直徑＜2.0 cm 者21 例，2～4 cm 者25 例，＞4 cm 者14 例。根據美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）2010 年版對臨床分期進行劃分：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期26 例。有淋巴結轉移者19 例，其中淋巴結轉移數目為1～3 枚者13 例，4 枚以上者6 例，無淋巴結轉移者41 例。同時選擇60 例癌旁正常上皮組織作為對照組。所有患者均進行電話隨訪，術后1 年內每3 個月隨訪1 次，術后第2 年每6個月隨訪1 次，從術后第3 年起每1 年隨訪1 次，共隨訪5 年。

1.2 主要試劑

兔抗人Bex1 和NF?kBp65 抗體、羊抗兔二抗均購自南京邁克沃德生物科技有限公司；DAB 顯色劑購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組化

所有石蠟組織標本經4%甲醛固定，常規石蠟包埋，4～5 μm 連續切片，脫蠟，高壓抗原修復等，采用EliVision 法行免疫組織化學染色。一抗Bex1、NF?kBp65 稀釋比例均為1∶300，一抗用PBS緩沖液代替作為陰性對照，TSCC 陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果評判

免疫組化結果由2位高年資病理科醫師在雙盲下閱片并記錄。每張切片隨機選取5個獨立高倍視野，計數100個腫瘤細胞。評分標準如下：①細胞著色強度，無著色或弱，0 分；淡黃色，1 分；棕黃色，2分；棕褐色：3 分；②染色陽性細胞百分數，＜5%，0分；5%～25%，1 分；26%～50%，2 分；＞50%，3分。總評分將兩項得分結果相乘：＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統計學分析

應用SPSS20.0 軟件包對數據進行統計學分析，計數資料用率表示，組間比較用卡方檢驗，相關性分析采用Pearson 檢驗；單因素生存分析用Kaplan?Meier 生存曲線和Log rank 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Bex1 和NF?kBp65 蛋白在TSCC 和癌旁正常上皮組織中的表達

Bex1 和NF?kBp65 主要染色于細胞漿，后者部分細胞核中也可見陽性染色，所有蛋白的陽性表達均呈棕黃色或棕褐色（圖1），Bex1 在TSCC 組織中低表達，NF?kBp65 在TSCC 組織中高表達。兩者在TSCC 組織和癌旁組織中的陽性率差異具有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

Figure 1 Immunohistochemical examination of Bex1 and NF?kBp65 expression in TSCC and adjacent normal tongue tissues（×200）圖1 Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 和癌旁正常舌組織中表達的免疫組織化學檢測（×200）

表1 TSCC 和癌旁正常組織中Bex1、NF?kBp65 的表達Table 1 The expression of Bex1 and NF?kBp65 in TSCC tissues and adjacent normal tissues n（%）

2.2 Bex1 和NF?kBp65 與TSCC 臨床病理特征的關系

結果顯示，Bex1 的陽性表達率與腫瘤直徑、TNM 分期及淋巴結轉移有關，差異有統計學意義（P＜0.05），而與性別、年齡、組織學分級均無關（P＞0.05）。NF?kBp65 的陽性表達率與TNM 分期、組織學分級和淋巴結轉移有關，差異有統計學意義（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑均無關（P＞0.05），見表2。

2.3 Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中表達的相關性

根據相關性分析顯示，Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中的表達呈負相關性（r＝?0.302，P＝0.019），見表3。

2.4 生存分析

Kaplan?Meier 生存分析顯示NF?kBp65 陽性表達與TSCC 患者的生存率無關（P＝0.674）；Bex1 陽性表達的TSCC 患者平均生存時間為56 個月，而Bex1 陰性表達的TSCC 患者平均生存時間為42 個月，差異有統計學意義（P < 0.05）。結果表明，Bex1 陽性表達的TSCC 患者生存率明顯高于陰性表達者（圖2）。

3 討 論

人腦表達X 連鎖Bex 家族由Bex1、Bex2、Bex3、Bex4、Bex5 五個成員組成，位于染色體Xq22 區域，Bex1 和Bex2 在C 末端附近包含一個保守的基序Ser?Leu?Arg，該基序被蛋白激酶C 磷酸化，蛋白激酶C 由10 個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，與許多癌癥相關［6?8］。Bex 蛋白參與神經變性、癌癥、細胞周期和腫瘤生長所涉及的轉錄調控和信號通路，并在一些惡性腫瘤中表達失調。Bex1 在肺腺癌中參與腫瘤的侵襲和轉移并且與患者不良預后有關［9］；Bex1 在食管鱗狀細胞癌中的低表達與食管鱗狀細胞癌的臨床預后不良相關，是影響總生存率的獨立預后因素，體外實驗結果顯示Bex1 可能通過NF?kB 信號通路抑制食管癌的增殖和生長而發揮抑癌作用［10］；在顱內室管膜瘤中存在啟動子高甲基化使Bex1 表達下調，而Bex1 過表達可抑制細胞的增殖［11］；Bex1 在伴有混合系白血病突變的急性髓系白血病中高表達，推測其可能起癌基因的作用［12］；Bex1 在一組FMS 樣絡氨酸激酶?3 驅動的急性白血病等疾病中表達下調等［13］。本研究結果顯示，Bex1 主要染色于細胞漿，在TSCC 中的陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，且與腫瘤直徑、TNM 分期、有無淋巴結轉移有關，而與患者性別、年齡、組織學分級無關，Kaplan?Meier 生存分析顯示Bex1 陽性表達患者的預后明顯優于陰性表達患者，表明Bex1 可能參與了TSCC 的侵襲和轉移，與TSCC 患者的不良預后有關。

表2 TSCC 中Bex1、NF?kBp65 的表達與臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between the expression of Bex1 and NF?kBp65 in TSCC and clinicopathologic features of patients with TSCC n（%）

表3 TSCC 中Bex1 和NF?kBp65 表達的相關性Table 3 Correlation of Bex1 and NF?kBp65 expression in TSCC

Figure 2 Kaplan?Meier survival curves of Bex1?positive and Bex1?negative TSCC patients圖2 Bex1 陽性表達和陰性表達TSCC 患者Kaplan Meier 生存曲線

NF?kB 包括5 個多肽鏈亞基，其中p65 是NF?kB的主要功能蛋白，能發揮轉錄激活功能。以p65 亞基磷酸化為特征的NF?kB 活化在惡性腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和轉移中發揮重要作用［3］。p65異常活化是NF?kB 通路激活的關鍵調控點，仍然是目前的研究熱點。本研究結果顯示，NF?kBp65 在TSCC 的表達明顯高于癌旁組織，主要染色于細胞漿，部分細胞核中出現陽性染色，且隨著TNM 分期增加，組織學分級越高、有淋巴結轉移者NF?kBp65的表達越強，與蔣麗蘭等［14］的研究結果一致。提示NF?kBp65 的異常活化在TSCC 的增殖、侵襲和轉移過程中可能起重要的促進作用。根據文獻報道，Bex 家族成員與NF?kB 通路之間有緊密聯系，Bex1 的過表達對NF?kB 的活性有顯著抑制作用［15］。本研究結果也表明Bex1、NF?kBp65 在TSCC組織中的表達呈負相關關系，提示NF?kB 信號通路可能參與了Bex1 促進TSCC 的增殖。

綜上所述，本研究發現相較于癌旁組織，TSCC中Bex1 陽性表達率低，NF?kBp65 陽性表達率高，其表達水平與TSCC 的發展有關，提示兩者可能與TSCC 的侵襲和轉移有關。Kaplan?Meier 生存分析結果顯示Bex1 陽性表達的平均生存時間長于陰性表達者，Bex1 的表達與患者的生存率有關，提示Bex1 對TSCC 的預后有一定的影響。本研究僅在組織學水平驗證了Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中的表達和相關性分析，而Bex1 是如何通過NF?kB 信號通路促進TSCC的增殖的機理仍有待進一步研究。