基于NGAL的模型在肝硬化急性腎損傷早期診斷和鑒別診斷中的意義

尹偉 李成忠

在國際腹水俱樂部《肝硬化患者急性腎損傷的診斷與管理專家共識(ICA2015)》[1]發布前，一些基于AKIN及KDIGO 標準的研究發現肝硬化患者并發急性腎損傷(AKI)可以涵蓋AKI的所有類型[2,3]，以腎前性氮質血癥(pre renal azotemia，PRA)、急性腎小管壞死(acute tubular necrosis，ATN)和肝腎綜合征(hepatorenals yndrome，HRS)最為常見，其他類型發病率則相對較低。從這一角度看，2007年乃至以前指南的HRS診斷標準缺少針對性的鑒別。所以從臨床的實際情況和肝硬化的病理基礎出發，本次ICA診斷標準在以提高敏感性的同時，除了用肝硬化急性腎損傷的概念來代替狹義的HRS外，還將鑒別診斷和個體化治療放到同等重要的位置上。根據新指南建議，需對AKI 2期以上或1期經過治療腎功能無恢復、且SCr>132.6 μmol/L的患者進行鑒別診斷。由于1型HRS和ATN短期內進展的速度相當快而治療方法卻截然不同，所以指南也希望在未來的研究中通過一些新的生物學標志物提高早期診斷及鑒別診斷的敏感性以免延誤治療。

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)是人脂質運載蛋白家族的新成員。1993年由Kjeldsen發現并命名[4]。在生理狀態下，NGAL在中性粒細胞及腎臟上皮細胞有微量表達。當腎臟發生局部缺血或損傷時，NGAL會由腎臟大量分泌，并進入尿液及血液中。既往的研究發現，腎損傷發生2 h后，血、尿NGAL濃度即可明顯升高，這一特性使得NGAL成為腎臟疾病尤其是AKI的早期標志物[5]。

資料與方法

一、病例資料

收集2017年1月至2019年1月在海軍軍醫大學長海醫院感染科住院的所有肝硬化(失代償期)的患者資料, 對住院期間的患者資料進行登記，監測住院期間的血肌酐變化，如符合肝硬化急性腎損傷的診斷標準，同時進行AKI分期。多次入院的患者僅記錄一次。

肝硬化急性腎損傷及肝腎綜合征診斷標準：參考2015年國際腹水俱樂部修訂推薦的《肝硬化患者急性腎損傷的診斷和管理共識》。

急性腎小管壞死的診斷標準：參考文獻[6]。由于肝硬化(失代償期)患者存在長期利尿、低血鈉等情況，所以濾過鈉排泄分數，尿鈉等指標的參考意義較差，診斷需要綜合病因及以上指標判斷。

排除標準：肝癌或罹患其他惡性腫瘤的患者；嚴重的其他心肺系統疾病；既往患有不同原因慢性腎臟病的患者和結構性腎損傷患者；沒有肝硬化基礎的慢加急性肝功能衰竭患者；妊娠期或哺乳期患者；慢性代謝性疾病如原發性醛固酮增多癥等患者。

二、研究方法

患者的資料采集：住院ID，年齡、性別、原發病病因、血壓(入院及并發AKI時)、肝功能指標(TBil、Alb、ALT、AST、血清鈉)、腎功能指標(SCr)、凝血功能(PT、INR)、醛固酮及血管緊張素Ⅱ、是否合并感染、感染類型、PCT、是否有AKI、AKI的類型。

標本收集和保存：患者首次診斷為肝硬化急性腎損傷后，取24 h內晨起中段尿，用無菌管收集，離心20 min(2000～3000 r/min)。收集上清-80℃凍存。

人uNGAL的檢測：試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司，Human Lipocalin-2/NGAL Quantikine ELISA Kit(R&D System,批號：20180106，20180604，20181219)，按照試劑說明書操作。

三、治療方法

一般治療：積極治療原發疾病，保肝、利尿、抗感染、抗病毒、營養支持等，白蛋白低于35 g/L補充白蛋白等。

AKI的鑒別診斷和治療：根據ICA2015診治共識的建議流程進行，根據患者的不同情況進行調整，對白蛋白正常或存在活動性上消化道出血的患者并發AKI，白蛋白的劑量酌減。

四、統計學方法

結 果

一、uNGAL在肝硬化急性腎損傷患者中的表達

共納入肝硬化(失代償期)患者804例，住院期間并發AKI或入院即存在AKI的患者216例，其中資料齊全的病例127例，納入10例肝硬化失代償但未并發AKI的患者為對照。結果顯示，肝硬化AKI患者的uNGAL為(462.72±265.42) ng/mL；未發生AKI的患者的uNGAL為(108.40±63.07) ng/mL。兩組比較差異有統計學意義(t=11.439,P=0.000)。

二、uNGAL在不同AKI類型患者中的表達

不同的AKI類型uNGAL的表達水平不同，PRA為(323.08±106.93)ng/mL; HRS為(486.27±164.67)ng/mL；ATN為(882.43±440.92)ng/mL，差異有統計學意義(F=48.774,P=0.000)；不同AKI類型uNGAL水平的組間比較差異均有統計學意義(PRA比HRS：標準誤為38.16；PRA比ATN：標準誤為56.98；HRS比ATN：標準誤為57.09，均P<0.01)。

由于不同AKI分期的AKI類型分布不同，根據AKI分期進行的亞組分析(表1)， AKI 1期診斷PRA 50例，HRS 14例，ATN 0例，NGAL分別為(306.79±70.88)、(331.81±67.73) ng/mL和0，差異無統計學意義(F=，P=0.243)。AKI 2期診斷PRA、HRS、ATN的NGAL分別為(358.84±64.11)、(512.74±148.85)和(747.94±239.20) ng/mL，差異有統計學意義(F=，P<0.01)。AKI 3期診斷PRA 0例，HRS 7例，ATN 6例，NGAL分別為0、(640.10±159.70)和(1136.71±593.18) ng/mL，差異有統計學意義(F=，P=0.046)。未發現ATN患者，兩項比較尿NGAL的差異無統計學意義；AKI 2期患者整體分析uNGAL的差異有統計學意義，但從組間比較看類似1期的結果，PRA和HRS的uNGAL差異無統計學意義(標準誤：73.86，P=0.125)，而HRS、PRA和ATN比較差異有均統計學意義(PRA vs ATN：標準誤：84.46，P=0.000；HRS vs ATN，標準誤：57.94，P=0.000)；3期無PRA的患者，結果顯示ATN的uNGAL比HRS明顯升高，但由于3期的患者病例數較少(HRS 7例；ATN 6例)，差異的結果雖有統計學意義但在0.05附近(P=0.046)。綜合分析：對于AKI 2期以上的患者，uNGAL對鑒別診斷ATN和非ATN型急性腎損傷意義較大；在AKI 1期和2期，早期通過uNGAL的水平，難以鑒別HRS和PRA。

從表2的結果看醛固酮和血管緊張素Ⅱ在不同類型的AKI患者中整體表達水平不同，但組間比較提示醛固酮的水平僅對PRA鑒別ATN有意義(標準誤：35.03，P=0.001)，PRA和HRS組的差異接近0.05(標準誤：22.77，P=0.051)；血管緊張素Ⅱ水平在鑒別PRA及非PRA型AKI有意義(PRA vs HRS：標準誤17.72，P=0.002；PRA vs ATN:標準誤：27.27，P=0.000)。在HRS組和ATN組，醛固酮(標準誤：35.03，P=0.113)和血管緊張素Ⅱ(標準誤：27.27，P=0.063)的表達水平差異均無統計學意義。

三、以uNGAL為基礎的早期鑒別診斷系統

將基線SCr、初次AKI分期、uNGAL、醛固酮、血管緊張素Ⅱ納入二元logistic回歸，得到鑒別ATN的預測方程，通過ROC曲線計算約登指數確定閾值。

表1 醛固酮和血管緊張素Ⅱ在不同AKI類型患者中的表達

表2 HRS和ATN的鑒別診斷的多因素分析

圖1 NGAL診斷ATN的ROC曲線

結果顯示：uNGAL是鑒別診斷ATN和HRS的獨立因素。ROC曲線分析(圖1)：uNGAL診斷ATN的ROC曲線下面積(AUC)為0.857，約登指數為522.72 ng/mL，敏感度為0.938，特異度為0.655。但此時特異度較低，如將特異度確定為0.800，則閾值為621.73 ng/mL，此時的敏感度為0.750，更符合臨床的需要。

討 論

國際腹水俱樂部對本次的指南進行了重大更新，在擴大概念的同時也強調了鑒別AKI類型的重要性，其中ATN和HRS的鑒別仍是待解決的關鍵問題之一。由于肝硬化(失代償期)患者常合并低蛋白血癥、低鈉血癥或同時使用高滲性利尿劑，ATN的診斷較為困難，所以指南中也建議通過新的生物學標志物輔助鑒別診斷。結合國外前期的部分探索，選擇了uNGAL作為早期鑒別診斷的關鍵因子。

以往的研究中顯示，NGAL的升高和AKI及AKI進展有關，比SCr更為敏感[7,8]。Kim等[9]證實了NGAL與sCr在診斷和分期中的敏感性，對于疑似敗血癥的重癥患者，pNGAL與序貫器官衰竭評估的腎亞組明顯相關性明顯優于sCr。而Hekmat等[10]對單側腎臟切除的器官捐獻者的評估顯示，一半的患者出現AKI， NGAL隨著AKI的進展而升高，其敏感性優于胱抑素C。NGAL的表達水平與AKI的進展相關，但作為診斷標準應用于肝硬化AKI的患者仍存在很多需要解決的問題，除了目前檢測方法還不統一，閾值的確定和檢測的時機是需要重點考慮的。

uNGAL的檢測結果顯示肝硬化AKI患者中表達水平明顯升高，相較于普通肝硬化失代償期患者差異有統計學意義。提示早期檢測uNGAL對于發現肝硬化AKI也有診斷價值。NGAL對AKI的診斷價值在多種疾病中已被證實[11-14]，在肝硬化AKI患者中也有過早期的探索。Verna等[15]曾使用2007年ICA肝腎綜合征的診斷標準來驗證尿NGAL的表達，結果顯示HRS患者的uNGAL水平在PRA患者和固有急性腎損傷(intrinsic acute kidney injury，iAKI)患者之間。Fagundes等[16]比較了肝硬化代償期，失代償期以及肝硬化合并腎損傷患者(包括PRA,HRS,ATN,CKD)uNGAL的水平，結果顯示，ATN患者的uNGAL表達要高于PRA、HRS和CKD的患者。Belcher等[17]在此基礎上應用KIDGO標準設計了一項多中心的前瞻性研究，測量了多種標志物(NGAL,KIM-1,IL-18,L-FABP)診斷ATN和非ATN型AKI的水平，結果顯示NGAL、IL-18、KIM-1、L-FABP和白蛋白的表達在ATN和非ATN患者中均有明顯的差異。ROC曲線顯示NGAL的曲線下面積最大(AUC=0.78)。基于此項研究，ICA在發布新指南中也對建議通過新的生物學標志物來加強鑒別診斷的特異性。Ariza等[18]檢測了肝硬化和慢加急性肝衰竭患者的多種標志物(AKI診斷采用AKIN標準，HRS診斷采用ICA2007標準)，結果發現在PRA、1型肝腎綜合征和ATN的患者中NGAL的表達水平有差異，其他對診斷ATN有意義的標志物有IL-18、白蛋白、TFF-3和GST-π，而KIM-1、β2微球蛋白等準確性較差。

本研究根據不同的AKI類型進行分組，uNGAL的表達水平各不相同。發現uNGAL隨著AKI進展持續升高，而3期患者多入院即存在AKI，缺失了早期的觀察，因此對于AKI 2期的鑒別診斷更為重要，尤其ATN的確定是重中之重。對AKI 2期患者的分析發現uNGAL在PRA、HRS和ATN的表達水平各有差異，但PRA和HRS的差異不明顯。說明uNGAL對鑒別ATN和非ATN型AKI有重要的意義。本研究還設計了血管緊張素Ⅱ和醛固酮的檢測作為輔助鑒別診斷HRS的預選因素，但結果顯示醛固酮和血管緊張素Ⅱ雖然在三種AKI類型的患者存在表達差異，但進一步分析顯示這兩種激素的水平僅對鑒別PRA和非PRA的患者有意義，其中醛固酮的意義更低。多因素分析也顯示以上兩種激素水平對鑒別HRS和ATN意義不大， uNGAL是鑒別診斷ATN的獨立因素。以約登指數確定的診斷ATN的uNGAL閾值為522.72 ng/mL，但此時敏感度較高，但特異度不足。Jaques等[19]一項前瞻性研究納入了105例肝硬化(失代償期)患者，其中55例確診AKI，分別在3個時間點監測了SCr、胱抑素C，NGAL(血液和尿液)、尿鈉、腎阻力指數(RRI)。結果顯示，PRA患者顯示比較低的SCr、NGAL和RRI；ATN患者有最高水平的NGAL、尿蛋白和尿鈉，HRS位于二者之間，所有生物學標志物均和AKI的嚴重程度平行。

綜上所述，雖然uNGAL可以早期輔助診斷肝硬化AKI，而且對ATN和非ATN型AKI有較高的鑒別診斷價值，但在臨床上仍需要綜合判斷。遺憾的是由于ATN的患者病例數較少，且集中于2、3期，在AKI 1期的鑒別診斷意義仍然需要在未來的研究中進一步探討。