白族藥千斤墜粗提物急性毒性初步研究

郭 羽 梁 攀 李昌虎 沈 磊 董 相 姜 北

大理大學藥物研究所，云南 大理 671000

千斤墜(Boschniakiahimalaica)為列當科草蓯蓉屬植物，又名丁座草，俗稱枇杷芋、寄母懷胎，生于海拔2200～4600 m的高山林下或灌叢，寄生于杜鵑根上或松樹根上；產云南大部分地區，大理有分布[1]。在白族醫藥中稱為“荒優脂”(洱源)“德厚優”“繼荒優”(云龍)“洋荒其”“瘦專脂”(劍川)“千荒優”(云龍關坪)[1]，具有理氣、止痛、止咳、祛痰、消脹、健胃等功效，用于胃痛、腹痛、跌打損傷、風濕關節痛等病癥[1]；文獻檢索結果顯示，該植物是否具有毒性方面記錄較為混亂，多數文獻未進行任何說明，少部分文獻史料則顯示該植物有小毒，其中尤以《白族慣用植物藥》相關記錄最為詳盡[1]：“本品有毒。①據經驗認為，服后能促使四肢汗出而邪去。②據民間使用經驗，該種在白花杜鵑下寄生的有毒，有麻感，只能作酒浸外用。紅花杜鵑下寄生的可內服。并視切片為白色者，副反應為吐瀉。以切片黃色者佳，無副反應”。但實際情況如何未見有研究報道，因此是否如記載所述不得而知。課題組在前期開展的試驗中發現，該植物可能具有一定的毒性與藥用安全隱患，在多數植物樣品常用的安全劑量范圍內，千斤墜提取物試驗組出現了小鼠大面積急性中毒甚至是死亡的現象。考慮到千斤墜在民族醫藥的常用性以及白族醫藥對該植物毒性方面的記述，該現象需要引起重視。為此，本研究針對千斤墜急性毒性以及寄生不同花色杜鵑下的千斤墜的毒性效果開展初步的研究工作，以期為該植物的安全應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 植物樣品試驗 用植物樣品于2017年6月5日采自云南大理蒼山大花甸至小花甸間，經大理大學生藥學教研室張德全副教授鑒定為列當科草蓯蓉屬植物千斤墜(BoschniakiahimalaicaHook. f. et Thomson)。采集時根據所寄生杜鵑花的顏色進行分類收集，最終整理成三組，分別是紅花杜鵑下千斤墜組、白花杜鵑下千斤墜組、其它生境千斤墜組；本研究供試樣品來自前兩組千斤墜。

1.2 儀器與試劑 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，COOL SAFE95-15冷凍干燥機(丹麥LABOGENE公司)，Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，甲醇[色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司]，超純水(娃哈哈飲用純凈水)，0.5% CMC-Na(羧甲基纖維素鈉，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，體質量(20±2) g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK(湘)2016-0002。小鼠分性別飼養于動物房內，以每天3 g/只喂標準顆粒飼料。

1.4 樣品制備 紅花杜鵑下與白花杜鵑下采集的兩個千斤墜樣品晾干后各取100 g粉碎，用70～80 ℃蒸餾水，超聲30 min，過濾，重復3次。濾渣再用蒸餾水加熱煮沸5 min進行粗提取，冷卻至室溫后，進行旋轉蒸發濃縮，最后冷凍干燥，分別得到提取物(紅花杜鵑下千斤墜)37.29 g、(白花杜鵑下千斤墜)37.31 g，提取率均為37.3%，密封備用。

1.5 急性毒性試驗

1.5.1 預試驗 取昆明種小鼠，隨機分為若干組，每組4只，雌雄各半，試驗前12 h禁食不禁水，各受試物均為1次灌胃給藥，空白對照組給予等量溶媒(0.5% CMC-Na)，試驗組給予不同劑量的供試樣品，灌胃體積為0.2 mL/10g。試驗劑量從1 g/kg開始測試，如果未出現小鼠死亡則增加劑量，直到出現死亡或達到最大給藥量。給藥后觀察并記錄動物的毒性反應，包括外觀體征，行為活動，精神狀態，食欲，大小便及顏色，被毛，膚色，呼吸及鼻、眼、口腔、生殖器等有無異常分泌物等[2]。

1.5.2 正式試驗 根據預試驗結果，紅花杜鵑下千斤墜粗提物達最大給藥量時未出現小鼠死亡，僅對白花杜鵑下千斤墜粗提物進行正式試驗。取昆明種小鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，試驗前12 h禁食不禁水，各受試物均為1次灌胃給藥，空白對照組給予等量溶媒(0.5% CMC-Na)，試驗組給予不同劑量的供試樣品，根據預試驗結果擬出以下4個給藥劑量組：6.25、8.75、12.25、17.15 g/kg，劑間比為1.4，灌胃體積為0.3 mL/10 g[3]。

于給藥前和給藥后每天進行1次體重測定。于給藥后0.5、1、2、4、6 h各觀察1次毒性反應，以后每天觀察1次，連續觀察14 d，記錄動物中毒表現和特點(包括外觀體征，行為活動，精神狀態，食欲，大小便及顏色，被毛，膚色，呼吸及鼻、眼、口腔、生殖器等有無異常分泌物)，毒性反應出現、消失時間、動物死亡時間。死亡小鼠及時摘取臟器并保存于10%中性甲醛。給藥14 d后，摘取未死小鼠主要臟器并保存[4]。所有臟器經脫水、包埋、切片、HE染色進行病理組織觀察。

1.6 HPLC分析 分別稱取紅、白兩色花杜鵑灌叢下寄生的千斤墜粗提物，用色譜純甲醇溶解為 5 mg/mL，0.22 μm濾膜過濾，裝于進樣瓶中并做好標記備用。

HPLC分析條件為：流動相CH3OH-H2O；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進樣體積10 μL；檢測波長225 nm；采用自動進樣，Agilent Zorbax SB-C18(5 μm, 4.6×150 mm)色譜柱。流動相為水(A)與甲醇(B)梯度洗脫，0～5 min 5%B；5～30 min 5%～30%B；30～90 min 30%-60%B。

2 實驗結果

2.1 預試驗 給予小鼠紅花杜鵑下寄生的千斤墜粗提物達最大給藥量(11 g/kg)時未觀察到小鼠死亡。給予小鼠白花杜鵑下寄生的千斤墜粗提物時觀察到小鼠死亡，死亡的最小劑量為12.25 g/kg。

2.2 正式試驗

2.2.1 白花杜鵑下千斤墜粗提物LD50測定 小鼠給藥后10 min內即發生毒性反應，具體癥狀如表1所述，持續時間較長，第二天未死亡小鼠精神及活動狀態開始好轉。死亡情況見表2。經計算，白花杜鵑灌叢下寄生的千斤墜粗提物LD50為 15.1 g/kg，95%可信限為12.26～24.20 g/kg。

表1 白花杜鵑下寄生千斤墜粗提物小鼠不同劑量組急性毒性癥狀

表2 白花杜鵑下寄生千斤墜粗提物不同劑量組死亡情況

2.2.2 白花杜鵑下千斤墜粗提物對小鼠體重的影響 小鼠于給藥后定量(3 g/只/d)喂食，體重監測14 d的統計結果見表3。結果表明，與空白對照組相比，除了第1、2天給予17.15 g/kg的小鼠有減輕外，其余各劑量小鼠的體重無明顯差異，說明白花杜鵑下千斤墜對小鼠體重無顯著性影響。

2.3 白花杜鵑下千斤墜粗提物對小鼠各臟器組織形態的影響 白花杜鵑下千斤墜對小鼠產生損傷的臟器有心臟、肝臟、肺臟和腎臟。具體病變為：心肌纖維斷裂，心肌細胞纖維化，心肌出血、充血并伴有部分炎細胞浸潤；肝充血，肝脂肪樣變性，肝細胞壞死；肺充血，肺出血，肺泡溶解；腎充血，腎出血，腎小管節段性壞死。組織病變結果如圖1所示。

表3 白花杜鵑下千斤墜急性毒性初步研究試驗體重變化的影響

2.4 HPLC圖譜對比研究 紅、白兩種花色杜鵑灌叢下采集的千斤墜植物樣品粗提物HPLC分析結果如圖2所示。

HPLC研究結果顯示，紅花杜鵑和白花杜鵑下采集的千斤墜樣品的粗提物，在檢測波長(225 nm)下顯示的主成分吸收峰差異不大。

3 討論

本項目初步研究結果顯示，白花杜鵑灌叢下寄生的千斤墜的粗提物其LD50為15.1 g/kg，介于有毒(LD50為5～15g/kg)和小毒(LD50為16～50 g/kg)之間[10]，據試驗現象可判定為有毒，具有致死性，會導致心、肝、肺、腎等臟器出現一定程度病變，需慎重使用。紅花杜鵑灌叢下寄生的千斤墜的粗提物在相似劑量時未觀察到致死性，說明其安全性稍好[13]。然而，由于兩種粗提物之間在試驗檢測條件下的HPLC主要譜峰近似、未見顯著差異，因此，初步推斷兩種不同花色杜鵑花樹下采集的千斤墜樣品粗提物毒性方面的差異可能是由毒性成分含量不同引起，或者是毒性成分為在HPLC譜圖上不易觀察到的某種微量成分，也可能是由于毒性成分在225 nm檢測波長處無顯著吸收活性，對此有待進一步研究明確。

本研究首次證明了白族醫藥記錄中關于不同來源千斤墜毒性存在差異的相關描述具有一定的可信度，為深入研究與正確使用千斤墜提供了初步的試驗依據。千斤墜為白族民間常用植物藥，常見泡酒內服或外用。根據本研究結果，若所使用的千斤墜來源不明時，有產生中毒的風險，需要引起注意。特別是由市場購置的千斤墜應以外用為宜，盡量避免盲目內服。