基于柵藻延遲發(fā)光檢測的不同產(chǎn)地及炮制方式連翹評價方法初探*

荊綺,楊美娜,龐靖祥，閔令圓,韓金祥△

(1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)生物醫(yī)學科學學院，濟南 250062；2.山東省醫(yī)藥生物技術研究中心，濟南 250062)

1 引 言

生物光子輻射又稱為超微弱生物發(fā)光(UPE)廣泛存在于各類生物體中，是一種極其微弱的低水平化學發(fā)光，波長范圍在 200 ～ 800 nm，對生物體內部的微小變化非常靈敏，與生物體內的信息傳遞、光合作用、細胞分裂等基本生命過程密切相關，能夠在一定程度上反映生物體內物質代謝水平[1-2]。生物超微弱發(fā)光檢測技術具有非破壞性、非侵入性、能提供時空信息等優(yōu)勢。因此，在醫(yī)學研究[3-5]等領域得到廣泛應用。

研究表明，生命物質中多模光子輻射與集體生物分子之間的一種相干非線性相互作用是生物光子發(fā)生的主要機制[1]，表明生物光子輻射強弱是生命體內部整體代謝變化的表現(xiàn)，中醫(yī)藥整體性理論與生物光子相性理論存在可通約性，有研究提出可將生物光子相干性理論等現(xiàn)代理論與中醫(yī)藥理論進行融合[6-7]。基于柵藻延遲發(fā)光初步表征中藥寒熱藥性的生物指示劑法是將不同寒熱藥性的中藥煎煮液加入柵藻指示劑中，通過對比加入中藥煎煮液前后的柵藻K值來量化表征中藥藥性[4，8]。該方法靈敏簡便，可操作性高。本研究以中藥連翹為實驗對象，利用柵藻生物指示劑法，探究分別加入5個產(chǎn)地、兩種不同炮制方式的中藥連翹煎煮液后柵藻生物指示劑的K值變化，得到K值的主要波動范圍，對不同產(chǎn)地及兩種炮制方式的連翹藥材藥性進行評價。

2 材料和方法

2.1 實驗儀器及材料

2.1.1儀器設備 光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、U-3900H紫外分光光度計、YPMS-2生物光子測量儀、PM20SP型光電倍增管高壓電源、ACCULAB電子天平、尚朋堂電陶爐、石英比色皿、康舒砂鍋。

2.1.2供試生物 柵藻(Scenedesmus sp．) 自中國科學院武漢水生生物研究所采購(編號 FACHB-933) ，使用 BG11 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

2.1.3連翹產(chǎn)地及炮制方式 山西安澤清蒸和生曬各4批次；河南清蒸4批次；河南生曬1批次；山東生曬1批次；陜西商洛清蒸3批次；陜西商洛生曬1批次；河北清蒸1批次。

2.2 方法

2.2.1柵藻培養(yǎng)及濃度測定 選取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的柵藻，將其接種于加入BG11 培養(yǎng)基的高壓滅菌的錐形瓶( 500 mL) 中，光照培養(yǎng)箱溫度25℃、光照強度4 000 Lux、光暗比為12∶12 h進行培養(yǎng)，培養(yǎng) 20 d后進行轉接，轉接比例為1∶5( 藻液: BG11 培養(yǎng)基)，按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)[8-9]；柵藻使用前需混勻藻液進行濃度測定，取4 cm×1 cm×1 cm的石英比色杯，加入均勻藻液3 mL，設定U-3900H紫外分光光度計波長為 680 nm測量藻液的吸光度，控制柵藻吸光度A=2.5，即柵藻細胞濃度C=3.0×107個/mL[9]。

2.2.2連翹煎煮液的制備 電子天平精確稱取10 g連翹，量筒量200 mL 水共同置于砂鍋中，浸泡藥材，30 min后，設置電磁爐功率為2 200 W，時間15 min，煎煮液劇烈沸騰后，減小加熱功率至800 W，加熱結束后，使用6層紗布過濾煎煮液，濾取濾液至250 mL燒杯中；將中藥濾渣再次置于砂鍋中，加入200 mL水，再次使用上述煎煮方法進行加熱，加熱結束后濾取濾液，棄中藥濾渣。將兩次煎煮液混合后置于砂鍋中，設置電磁爐功率為2 200 W，加熱至煎煮液沸騰后，減小加熱功率至800 W，持續(xù)加熱，直至煎煮液體積濃縮至50 mL,4℃保存24 h后使用[4，9]。

2.2.3中藥煎煮液柵藻指示劑延遲發(fā)光測量 在石英比色杯中加入2.2.1條件下均勻柵藻溶液3 mL，取100 μL連翹煎煮液上清與藻液混勻，將該石英比色杯置于YPMS-2生物光子測量儀的暗室內，暗適應15 min，儀器設置為：光源白色LED；測量點900；選擇測量方法DL；測量時間1.000000；光照時間10 s；重復次數(shù)7[8-9]，之后進行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測。

3 實驗結果

3.1 數(shù)據(jù)處理分析[8-9]

使用軟件statistica10.0處理激發(fā)延遲發(fā)光實驗數(shù)據(jù)，運用式(1)進行“雙曲”擬合，式(2)計算延遲發(fā)光平均強度(IW)，將 IW與t進行線性擬合，得到相應的線性擬合方程。其中斜率K表征了柵藻在不同的液體環(huán)境中延遲發(fā)光的動力學演化行為，可表征樣品性質。

I(t)=A×csch2(t/B+C)

(1)

IW=A×B/W×[cothC-coth(W/B+C)]

(2)

其中，A為強度參量，B為特征時間，C為位相因子，W為總的測量時間。

3.2 各個產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值比較

將柵藻藻液加入石英比色杯中，在2.2.1條件下，吸取連翹煎煮液加入柵藻中，進行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測，再進行K值擬合，將全部連翹煎煮液進行相同操作，得到各個產(chǎn)地兩種炮制方式所有批次連翹煎煮液的柵藻K值。首先使用SPSS19.0將相同產(chǎn)地和炮制方式的不同批次連翹的K值進行獨立樣本t檢驗；其次取山西安澤、河南、陜西商洛三個產(chǎn)地兩種炮制方式的連翹煎煮液，并將同一產(chǎn)地清蒸與生曬的連翹煎煮液K值使用SPSS19.0分別進行獨立樣本t檢驗；最后將擬合得到的K值分為清蒸和生曬兩組，對各組中不同產(chǎn)地連翹煎煮液K值使用SPSS19.0分別進行獨立樣本t檢驗。

3.2.1同一產(chǎn)地及炮制方式不同批次連翹煎煮液柵藻K值比較 對相同產(chǎn)地及炮制方式的不同批次連翹煎煮液的柵藻K值進行對比分析，見圖1。圖1(a)、(b)分別為山西清蒸連翹及山西生曬連翹不同批次K值測定；圖1(C)為河南清蒸連翹不同批次K值測定；圖1(D)為陜西清蒸連翹不同批次K值測定；圖1(E)為山東生曬連翹不同批次K值測定。結果表明，同一產(chǎn)地相同炮制方式的不同批次連翹煎煮液柵藻K值不存在顯著性差異。

圖1 同一產(chǎn)地及炮制方式不同批次連翹K值比較Fig. 1 Comparison of K values of Forsythia suspensa in different batches of the same origins and processing method

3.2.2不同產(chǎn)地及炮制方式連翹煎煮液柵藻K值比較 圖2為相同產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值比較，SXAN、HN、SXSL分別代表山西安澤、河南和陜西商洛三個產(chǎn)地，結果表明，相同產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值之間均存在顯著性差異，且相同產(chǎn)地清蒸連翹煎煮液柵藻K值均高于生曬連翹煎煮液柵藻K值。

圖2 同一產(chǎn)地不同炮制方式K值比較(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)Fig.2 Comparison of K values of different processing methods in the same origin(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

不同產(chǎn)地兩種炮制方式煎煮液柵藻K值比較，見圖3。QZ代表清蒸連翹，SS代表生曬連翹，結果表明，不同產(chǎn)地清蒸和生曬連翹煎煮液柵藻K值比較中，產(chǎn)地間均存在顯著性差異。

圖3 不同產(chǎn)地不同炮制方式K值比較(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

3.3 連翹煎煮液柵藻K值波動范圍

將不同產(chǎn)地兩種炮制方式所有批次連翹煎煮液柵藻K值進行統(tǒng)計分析，最終得到連翹煎煮液柵藻K值波動范圍，見圖4。結果表明，不同產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值范圍為0.9806～3.8021，主要波動范圍為2.05～2.48。

圖4 連翹K值波動范圍Fig.4 Fluctuation range of forsythia K values

4 討論

連翹具有抗菌抗炎、抗病毒、神經(jīng)保護等作用[10-16]。目前，對于中藥的研究主要是對中藥的主要化學成分及其次生代謝產(chǎn)物進行研究[17-18]，該研究思想主要基于西方醫(yī)學研究中的還原論，而非基于中藥基礎理論的整體觀念明確中藥對生物體整體代謝功能的影響[19]。由于生物光子相干性理論與中醫(yī)藥研究中整體論具有相似特征[6]，因此，將中藥藥性通過對柵藻激發(fā)延遲發(fā)光數(shù)據(jù)處理得到的K值來量化表征藥性的方法，符合中醫(yī)整體觀。本研究前期實驗結果證明柵藻K值的正常波動范圍為2.81～3.89[9]，本實驗結果表明，加入連翹煎煮液后的柵藻K值的主要波動范圍為2.05～2.48，明顯低于空白柵藻K值，可能由于連翹藥性為寒性，降低柵藻內部代謝反應，造成加入連翹煎煮液后的柵藻K值降低，這也與中藥藥性基本理論中的整體觀念相吻合。本研究以柵藻作為生物指示劑對不同產(chǎn)地及炮制方式的連翹藥性進行評價，結果表明，相同產(chǎn)地和炮制方式的不同批次連翹煎煮液柵藻K值不存在顯著性差異；不同產(chǎn)地相同炮制方式連翹煎煮液柵藻K值均存在顯著性差異，且清蒸連翹煎煮液柵藻K值高于生曬連翹煎煮液柵藻K值，考慮可能與連翹清蒸與生曬加工中導致主要化學成分含量變化有關。在相同炮制方式不同產(chǎn)地連翹煎煮液柵藻K值比較中，產(chǎn)地之間均存在顯著性差異，考慮可能與生長環(huán)境不同對連翹質量造成影響。因此本研究中以柵藻作為生物指示劑對不同產(chǎn)地及炮制方式的同一中藥進行評價，為中藥的質量評價提供了更多依據(jù)。但是，柵藻生物指示劑法也僅僅是對于中藥藥性客觀化表述的初步研究，仍然無法完全準確反映中藥寒熱藥性的問題。因此，對于柵藻激發(fā)延遲發(fā)光測定K值來表征中藥寒熱藥性，仍需大量實驗進行驗證，同時對中藥藥材的客觀評價方法也需要進一步補充和探索。