電化學方法檢測血漿游離DNA甲基化水平與甲狀腺癌診斷以及相關臨床特征的關系

闞志文 黃子杰 崔亞云 錢立庭

1安徽醫科大學附屬省立醫院放療科（合肥230001）；2南方醫科大學南方醫院（廣州510515）

甲狀腺癌是最常見的惡性腫瘤，甲狀腺癌遠處轉移及侵犯與預后密切相關［1-2］，所以甲狀腺癌的早篩極為重要，當前的首選早篩方法為超聲。目前，液體活檢正受到醫學界的關注，基于PCR 以及測序技術的cfDNA甲基化檢測成為新的焦點［3-4］，其具有時間長、耗費高等缺點。SINA，Abu Ali Ibn，等人開發出一種基于電化學的檢測方法，具有快捷靈敏廉價等優勢，但沒有進行甲狀腺癌相關檢測。本研究通過電化學方法對甲狀腺癌、甲狀腺良性病變與正常人血漿cfDNA 進行檢測分析，在參照正常血漿cfDNA 基礎上評估甲狀腺良性病變、甲狀腺癌的電流吸附率水平，初步探討其在甲狀腺癌中的診斷價值和效能以及與甲狀腺結節TI-ADRS 分級、臨床病理特征等關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料甲狀腺結節患者納入標準：（1）超聲診斷甲狀腺結節TI-RADS分級為2級以上；（2）初次就診，此前未經手術。放化療及生物治療。排除標準：（1）甲狀腺疾病治療后的患者；（2）罹患其他類型癌癥；（3）沒有確切病理診斷的患者。正常人納入標準：（1）沒有患癌史；（2）體檢無異常占位及結節病。最終納入2019年3-7月于安徽省腫瘤醫院的甲狀腺結節患者149 例，其中甲狀腺癌患者114 例，年齡（38.8 ± 13.4）歲；良性病變者35例，年齡（49.8±12.6）歲；來自中山大學腫瘤防治中心體檢正常人血漿35 例作為對照組，年齡（36.9 ±10.1）歲。

1.2 實驗材料

1.2.1 電化學工作站及電化學相關材料高通量全自動化核酸提取站（奧美泰克），電化學工作站（辰華chi660e），配備金電極，鉑電極，銀電極以及電極打磨機（Gaoss Union），亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀，超聲清洗儀。

1.2.2 DNA提取相關試劑來自天根（tiangen）生化科技公司的DNA 提取試劑：Proteinase K，Buffer A，異丙醇-鹽酸胍混合物，EB 洗脫液等。

1.3 方法收集所有患者的血漿樣本，并提取血漿DNA，使用電化學方法測得每個患者的血漿cfDNA 電流吸附率水平，取樣本血漿0.5 mL，利用高通量全自動化核酸提取站（奧美泰克）提取血漿cfDNA，置于磁力板上吸取上層cfDNA 清液35微升轉入1.5 mL EP 管中，放入金電極10 min，電解池為超聲打磨過鉑電極，銀電極，電解液為亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀溶液（200 mL 純水，亞鐵氰化鉀0.211 g，亞鐵氰化鉀0.162 g），將鉑電極、銀電極及金電極放入電解池中分別連接電化學工作站，采用循環伏安法檢測，氧化峰在0.2 V，基線電流取5.3 ～5.63e 之間，DNA 的吸附率計算公式為DNA電流吸附率=（基線電流-測量電流）∕基線電流×100%，測量三次取平均值（圖1）。以病理結果為金標準，將被檢測樣品分為正常組（NC 組），甲狀腺良性病變組（BC 組）和甲狀腺癌組（TC 組），分別檢測三組的吸附率并記錄（圖2）。根據甲狀腺癌診療規范（2018 版）TI-DARS 分類，本批甲狀腺癌根據超聲將結節分為2 類、3 類、4a 類、4b 類、4c 類、5 類、6 類，觀察不同分類結節DNA 電流吸附率情況。根據甲狀腺癌診療規范（2018 版）將癌灶大小、淋巴結轉移、局部侵犯、多中心性、TNM 分期等影響腫瘤預后的因素納入統計學分析，觀察與血漿DNA 電流吸附率關系。

圖1 血漿cfDNA（游離DNA）電流吸附情況示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasma cfDNA（free DNA）current adsorption

圖2 TC 組、BC 組及NC 組吸附率Fig.2 Adsorption rate of TC group，BC group and NC group

1.4 統計學方法使用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，以病理結果為金標準，計量資料采用（）表示。組間比較采用單因素方差分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。血漿cfDNA 電流吸附率水平診斷甲狀腺癌的效能評價采用受試者工作特征（ROC）曲線分析；ir 值與TI-RADS 分級的檢驗采用秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。ir 值與甲狀腺癌多項病理特征采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義；運用Logistic 回歸分析對甲狀腺癌血漿cfDNA電流吸附率水平等因素進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TC、BC、NC 組樣本一般特征比較TC（甲狀腺癌）組114 例，其中男28 例，女86 例，年齡為（38.8 ± 13.4）歲；BC（甲狀腺良性病變）組35 例，其中男8 例，女27 例，年齡為（49.8 ± 12.6）歲：NC（正常對照）組35 例，其中男14 例，女21 例，年齡為（36.9 ± 10.1）歲，3 組性別差異無統計學意義（P＞0.05），年齡差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 DNA 電流吸附率對甲狀腺癌的早期診斷具有一定的意義TC 組與NC 組ir值的ROC 曲線下面積為0.723，差異有統計學意義（P＜0.05）；TC與BC 組ir值的ROC 曲線下面積為0.778，差異有統計學意義（P＜0.05）；BC 與NC 組ir值的ROC 曲線下面積為0.384，差異無統計學意義（P=0.094），3 組檢測靈敏度為61.4%，特異度為68.6%，準確度為64.1%，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3-5。

圖3 TC 組與NC 組ir 值診斷甲狀腺癌的ROC 曲線Fig.3 ROC curve of thyroid cancer diagnosed by IR value in TC group and NC group

2.3 甲狀腺癌組與良性結節組的TI-DARS 分級與吸附率情況比較以cutoff 值29 為界，將吸附率（ir）分為＜29 組和≥29 組，兩組的TI-DARS 分級情況比較差異有統計學意義（P＜0.05）。ir 值≥29組TI-ADRS 分級4c、5級比例顯著高于ir值＜29組；ir值＜29組TI-ADRS 分級3 級比例顯著高于ir 值≥29 組，在4a、4b 級中，兩組比例相差不大（表1）。

圖4 TC 組與BC 組ir 值診斷甲狀腺癌的ROC 曲線Fig.4 ROC curve of ir value in thyroid cancer diagnosis between TC group and BC group

圖5 BC 組與NC 組ir 值的ROC 曲線Fig.5 ROC curve of ir value of BC group and NC group

2.4 甲狀腺癌組中腫瘤臨床病理特征與甲狀腺癌吸附率情況分析以cutoff 值29 為界，將吸附率（ir%）分為＜29 組和≥29 組，在癌灶大小、淋巴結轉移、局部侵犯、多中心性中的差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.5 關于甲狀腺癌的Logistic 回歸分析將ir 值（≥29=1，＜29=0）、年齡、性別（女=0，男=1）作為自變量，以甲狀腺結節最終診斷為因變量（甲狀腺癌=1，良性結節=0）進行Logistic 回歸進行分析發現ir 值≥29 回歸系數=0.257，OR= 1.293，ir 值≥29 是甲狀腺癌的獨立危險因素，ir 值越高，甲狀腺癌風險越大（P＜0.01），見表3。

3 討論

甲狀腺癌多發于青壯年，早期無明顯癥狀，大多表現為甲狀腺結節，現有的早篩手段主要是超聲，而在超聲診斷的高危結節中，仍有很大一部分是良性病變，結構性檢查（FNA）是甲狀腺癌檢查的金標準［5-7］，利用細針對甲狀腺結節進行穿刺，從中獲取細胞成分，通過細胞學診斷對目標病灶性質進行判斷。但超聲引導下穿刺活檢存在一些限制，如有出血、感染風險，穿刺針途徑可能損傷臨近重要器官，限制女性經期等［8］。甲狀腺癌的液體活檢相比于結構性檢查有著創傷性小的優點，其中甲基化的研究是當下的熱門領域。甲基化是真核生物基因表達調控方式，也是一種特有的表觀遺傳學現象。基因的高甲基化也參與了多種腫瘤的形成發生與發展［9-11］，DNA 的甲基化水平在國外有些學者的研究中也成為影響甲狀腺癌預后的新的評價指標［12］。隨著近年來國內外的學者對循環腫瘤DNA（ctDNA）的研究日益增多，有學者發現血液中ctDNA 的含量有助于甲狀腺良惡性結節的鑒別診斷［13］。高甲基化水平ctDNA 也被認為是肝癌診斷和預后的重要分子標記物［14］。甲狀腺癌患者的臨床病理特征決定了術后甲狀腺癌患者的進一步治療方案，DNA 的甲基化水平有望與甲狀腺癌患者眾多的臨床病理特征一樣成為指導甲狀腺癌患者治療的一項指標［15］。當前DNA 甲基化檢測主要是基于PCR以及二代測序等技術，有耗時長且繁瑣、技術要求高、價格昂貴等缺點［16］。因此亟需一種新型的血漿cfDNA 甲基化檢測技術。SINA等［17］發現了啟動子區高甲基化基團DNA在金表面會聚集成團的特性，并以此用來檢測乳腺癌等癌癥患者血漿中的cfDNA 電流吸附率水平，以此來衡量乳腺癌等癌癥中啟動子區甲基化水平。電化學作為一種新興的檢測方法，有著快速、簡單、價格低廉的優點，既往文獻中沒有類似的甲狀腺癌血漿cfDNA 吸附率檢測方法對甲狀腺癌的早期診斷的報道。本研究發現血漿cfDNA 電流吸附率水平（ir 值）對甲狀腺癌的早期診斷具有一定的意義；甲狀腺癌cfDNA 的ir 值在TI-RADS 分級中差異具有統計學意義（P＜0.05），甲狀腺癌高吸附率水平（ir ≥29）在TI-RADS 分級高組的比例明顯高于低級組。本研究中ir 值≥29 組與＜29 組在癌灶大小、淋巴結轉移、局部侵犯、多中心性、TNM 分

期等甲狀腺癌病理特征中的差異無統計學意義（P＞0.05）。經過分析發現ir 值≥29 是甲狀腺癌的獨立危險因素OR=1.244（P＜0.01）。

表1 ir 值相關的TI-DARS 分級情況Tab.1 Ir value related Ti-DARs grading 例（%）

表2 ir 值與各病理特征之間的相關性分析Tab.2 Correlation analysis between IR value and pathological features例

表3 甲狀腺癌危險因素的logistic 回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of thyroid cancer risk factors

本研究也具有一定的局限性，甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）的cfDNA 電流吸附率較低，由于大多數PTMC 是一種惰性疾病，腫瘤發展有限，大多數情況下甚至不生長發展［18］，分析原因可能是釋放入血漿的高甲基化水平的cfDNA 量有限，影響cfDNA 電流吸附率，進而對本研究的檢測結果產生影響。

血漿cfDNA 電流吸附率水平（ir 值）對甲狀腺癌的診斷具有一定的意義；ir 值在癌灶大小、淋巴結轉移、局部侵犯、多中心性、TNM 分期等甲狀腺癌病理特征中的差異無統計學意義；ir ≥29 是甲狀腺癌的一個獨立危險因素；ir 值與TI-ADRS 分級相關。本研究結果對甲狀腺癌早期診斷，判斷預后及給予臨床后續治療有著一定的參考作用。