5-HT7受體在三叉神經(jīng)節(jié)電刺激引起的硬腦膜血漿蛋白外滲中的作用

王小娟 梁鑒波

1廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州510180）；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州510080）

偏頭痛的病理生理機(jī)制目前尚未完全明確，普遍認(rèn)為與三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)（trigeminovascular system，TGVS）的激活和敏化相關(guān)［1］。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）的釋放、神經(jīng)源性硬腦膜血管擴(kuò)張（neurogenic dural vasodilatation，NDV）、硬腦膜血漿蛋白外滲（plasma protein extravasation，PPE）等神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)是TGVS 激活的主要表現(xiàn)［2-3］。

目前臨床上偏頭痛急性發(fā)作的特異性藥物療效不滿意，曲坦類藥（選擇性5-HT1B∕1D受體激動(dòng)劑）和CGRP 靶向新藥對部分患者無效［4-5］，提示偏頭痛可能有其他未知機(jī)制和治療切入點(diǎn)。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)5-HT7受體在疼痛調(diào)節(jié)中有重要作用［6］，5-HT7受體可能是疼痛治療的潛在靶點(diǎn)。本課題組已初步發(fā)現(xiàn)選擇性阻斷5-HT7受體可抑制TGVS 激活誘導(dǎo)的CGRP 釋放［7］、5-HT7受體參與調(diào)節(jié)TGVS激活誘發(fā)的NDV［8］；此外，有研究［9］顯示電針可通過抑制5-HT7受體的活化改善偏頭痛大鼠的中樞敏感性。這些均提示5-HT7受體可能與偏頭痛相關(guān)。硬腦膜PPE 是偏頭痛神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要特征，它是動(dòng)物模型中偏頭痛樣病理改變的指標(biāo)［10］，但PPE 的病理機(jī)制目前仍未十分明確，5-HT7受體是否參與硬腦膜PPE 在國內(nèi)外均未見有報(bào)道。基于此，本研究通過構(gòu)建三叉神經(jīng)節(jié)電刺激偏頭痛大鼠模型，初步探討5-HT7受體在硬腦膜PPE 中的作用，為研究5-HT7受體在偏頭痛發(fā)病機(jī)制中的作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料5-HT7受體拮抗劑SB269970（美國Tocris），5-HT7受體激動(dòng)劑AS19（美國Tocris），舒馬曲坦（sumatriptan，美國Sigma），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美國Sigma），伊文思藍(lán)（美國Sigma），大鼠腦立體定位儀（日本Narishige），SD9 電生理程控刺激儀（美國Grass），恒溫電熱毯（深圳瑞沃德），DGG-9023A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信），熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組6 ～8 周齡雄性Sprague-Dawley大鼠（體重180 ～220 g），隨機(jī)分為7組（每組5 只）：舒馬曲坦組（陽性對照）、SB269970（5 mg∕kg）組、SB269970（10 mg∕kg）組、AS19（5 mg∕kg）組、AS19（10 mg∕kg）組，因不同藥物的溶劑不一樣，故特設(shè)生理鹽水（normal saline，NS）和1% DMSO 兩個(gè)陰性對照組。

1.3 方法

1.3.1 藥物預(yù)處理舒馬曲坦、SB269970 均用NS 溶解，AS19 用1% DMSO 溶解；所有藥物、NS及1% DMSO 的注射劑量均為2 mL∕kg。舒馬曲坦（300 μg∕kg）為靜脈注射（i.v.），而SB269970（5 mg∕kg，10 mg∕kg）、AS19（5 mg∕kg，10 mg∕kg）、NS 及1%DMSO 均為皮下注射（s.c.）；所有藥物、NS 及DMSO均在三叉神經(jīng)節(jié)電刺激前30 min 給藥。

1.3.2 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)電刺激模型的制備所有動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，自由進(jìn)水。使用10%水合氯醛腹腔注射（劑量0.35 mL∕100 g）麻醉大鼠，然后將大鼠水平仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒備皮，暴露右側(cè)頸外靜脈并留置靜脈導(dǎo)管用于注射藥物及伊文思藍(lán)。接著將麻醉的大鼠固定在立體定位儀上，參考文獻(xiàn)［11］制作模型：門齒固定插設(shè)在正中處，常規(guī)消毒備皮，頭頂正中“十”字形切開皮膚，暴露雙側(cè)頂骨，用牙科鉆在雙側(cè)頂骨中心小心鉆開直徑約為5 mm 的圓形孔，在前囟旁3.0 mm、前囟后3.2 mm 處，將微電極垂直插入右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)，深度為硬腦膜下9.2 mm。電刺激器采用SD9 電生理程控刺激儀（美國Grass），電刺激參數(shù)為5 Hz、5 ms、0.6 mA，持續(xù)時(shí)間為5 min。對側(cè)只插微電極不刺激。用生理鹽水浸過的紗布覆蓋顱頂，以防失水干燥。術(shù)中用恒溫電熱毯保持肛溫37 ℃。

1.3.3 硬腦膜血漿蛋白滲出的檢測在三叉神經(jīng)節(jié)電刺激前5 min從頸外靜脈注入伊文思藍(lán)（50 mg∕kg，2%），刺激結(jié)束5 min 后馬上開胸用生理鹽水經(jīng)心臟灌注5 min，然后斷頭開顱、小心分離雙側(cè)硬腦膜，用雙蒸水漂洗3 次后展平裱到載玻片上，置于37 ℃烤箱烘15 min，再用80%甘油封片，最后用熒光顯微鏡拍攝雙側(cè)硬腦膜PPE 情況，所有硬腦膜標(biāo)本的熒光拍攝曝光時(shí)間均為1.22 s，其它條件設(shè)置不變。感興趣區(qū)（region of interest，ROI）主要定在腦膜中動(dòng)脈各分支交叉處、分支及主干交叉處，位于微電極穿刺點(diǎn)附近的腦膜區(qū)域需除外。ROI大小為40 000～80 000 μm2，每張硬腦膜標(biāo)本各取5～8 個(gè)ROIs，用軟件計(jì)算各個(gè)ROI 的灰度值，并統(tǒng)計(jì)每張硬腦膜標(biāo)本的熒光灰度值均值，血漿蛋白外滲率（PPE ratio）＝刺激側(cè)（右側(cè)）灰度值均值∕對側(cè)（左側(cè)）灰度值均值［12］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組數(shù)據(jù)計(jì)量資料用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型的成功建立三叉神經(jīng)節(jié)電刺激的同時(shí)可見大鼠刺激側(cè)（右側(cè)）咀嚼肌收縮，同側(cè)口鼻分泌物增多及口面部區(qū)域逐漸出現(xiàn)藍(lán)染（伊文思藍(lán)外滲，圖1），提示刺激點(diǎn)位于右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)；刺激對側(cè)無上述表現(xiàn)。通過熒光顯微鏡顯示在同等曝光條件下，電刺激同側(cè)的硬腦膜紅色熒光明顯比對側(cè)及正常大鼠的強(qiáng)（圖2）。這些表現(xiàn)證明模型的成功建立，同時(shí)說明單側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)電刺激只會(huì)引起同側(cè)TGVS 激活和同側(cè)硬腦膜PPE。

2.2 5-HT7 受體激動(dòng)劑、拮抗劑對三叉神經(jīng)節(jié)電刺激引起的硬腦膜PPE 的影響陰性對照NS 組與DMSO 組的PPE 率分別為（1.68 ± 0.19）、（1.65 ±0.12），陽性對照舒馬曲坦組PPE率為（1.26±0.14）；SB269970（5 mg∕kg）組、SB269970（10 mg∕kg）組PPE率分別為（1.73±0.16）、（1.68±0.12），AS19（5 mg∕kg）組、AS19（10 mg∕kg）組PPE 率分別為（1.74±0.12）、（1.67 ± 0.16）。舒馬曲坦組PPE 率較其他各組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005），提示舒馬曲坦明顯抑制三叉神經(jīng)節(jié)電刺激后刺激側(cè)的硬腦膜PPE。NS 組與DMSO 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明兩個(gè)陰性對照組的PPE 率相近，溶劑DMSO 對PPE 無明顯影響。AS19 和SB269970 不同劑量組的PPE 率與NS、DMSO 對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明AS19、SB269970 均對刺激側(cè)的硬腦膜PPE 無明顯作用。見圖3。

圖1 三叉神經(jīng)節(jié)電刺激后同側(cè)口面部出現(xiàn)伊文思藍(lán)外滲Fig.1 Evans blue extravasation in the ipsilateral oro-facial regions following electrical stimulation of the trigeminal ganglion

3 討論

在偏頭痛三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說中，神經(jīng)源性炎癥是TGVS 激活后三叉神經(jīng)末梢釋放以CGRP為主的神經(jīng)遞質(zhì)引起的無菌性炎癥，而硬腦膜PPE 則是其中一個(gè)關(guān)鍵特征［2-3］。逆行性刺激TGVS 會(huì)引起動(dòng)物頭面部及硬腦膜出現(xiàn)PPE，抗偏頭痛藥物舒馬曲坦、拉米地坦、帕雷昔布均能顯著抑制偏頭痛動(dòng)物模型的硬腦膜PPE［11，13-14］。很多研究通過對神經(jīng)源性偏頭痛動(dòng)物模型的硬腦膜PPE 定量來評(píng)價(jià)TGVS 的激活程度及研究藥物對偏頭痛的作用。伊文思藍(lán)是一種能與血漿蛋白高度親和的熒光染料，結(jié)合了伊文思藍(lán)的血漿蛋白外滲區(qū)域會(huì)出現(xiàn)藍(lán)染，在熒光顯微鏡下被激發(fā)成紅色熒光，血漿蛋白滲出量與神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)程度成正比［14-15］，可用于定量評(píng)價(jià)偏頭痛動(dòng)物模型硬腦膜PPE。

圖2 三叉神經(jīng)節(jié)電刺激后硬腦膜血漿蛋白外滲（PPE）在熒光顯微鏡下的對比Fig.2 Comparison of dural plasma protein extravasation evoked by electrical stimulation of the trigeminal ganglion under the fluorescence microscope

圖3 各組硬腦膜血漿蛋白外滲率（PPE ratio）Fig.3 Ratio of dural plasma protein extravasation in each group

本研究成功構(gòu)建了偏頭痛動(dòng)物模型，通過電刺激大鼠右側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)使TGVS 激活，誘發(fā)同側(cè)顏面部和硬腦膜出現(xiàn)PPE，表現(xiàn)為同側(cè)顏面部出現(xiàn)藍(lán)染，在熒光顯微鏡同等曝光條件下同側(cè)硬腦膜標(biāo)本的熒光強(qiáng)度明顯比對側(cè)的強(qiáng)。選擇性5-HT1B∕1D受體激動(dòng)劑舒馬曲坦是偏頭痛特異性治療的經(jīng)典藥物，本研究使用該藥作為陽性對照，結(jié)果顯示舒馬曲坦可明顯減少三叉神經(jīng)節(jié)電刺激誘發(fā)的同側(cè)硬腦膜PPE，這與文獻(xiàn)報(bào)道相似［11，14］。為了探討5-HT7受體是否參與PPE，本研究在電刺激前分別通過注射AS19 和SB269970 來選擇性激動(dòng)和拮抗5-HT7受體，然而結(jié)果顯示不同劑量的AS19 和SB269970 對硬腦膜PPE 均無明顯影響，提示5-HT7受體可能未參與TGVS激活誘發(fā)的硬腦膜PPE。本實(shí)驗(yàn)所采用的AS19 和SB269970 劑量足夠作用于5-HT7受體［16-17］，故因AS19和SB269970劑量不足導(dǎo)致假陰性結(jié)果的可能性不大。

TGVS 激活后硬腦膜神經(jīng)源性炎癥涉及CGRP釋放、NDV 及PPE。抑制CGRP 生成和釋放具有緩解痛覺過敏的作用［18］。本課題組曾報(bào)道在偏頭痛動(dòng)物模型中選擇性阻斷5-HT7受體可抑制TGVS 激活誘導(dǎo)的CGRP 釋放，5-HT7受體激動(dòng)劑可部分逆轉(zhuǎn)前者的作用，提示5-HT7受體可能參與偏頭痛TGVS 激活誘導(dǎo)的CGRP 釋放機(jī)制［7］；干預(yù)5-HT7受體會(huì)影響腦膜中動(dòng)脈的基礎(chǔ)血流量和電刺激誘發(fā)的血管擴(kuò)張，表明5-HT7受體可能介導(dǎo)TGVS 激活后的NDV［8］。這提示5-HT7受體可能是偏頭痛治療的新切入點(diǎn)。但本研究顯示5-HT7受體可能未參與硬腦膜PPE，分析原因可能與CGRP 在硬膜PPE 中的作用較小相關(guān)［19］。CGRP 對硬腦膜PPE的影響仍存爭議，CGRP 作為偏頭痛病理機(jī)制中的關(guān)鍵遞質(zhì)，特異性治療藥物曲坦類藥和CGRP 靶向藥物都是通過抑制CGRP 的釋放或阻斷CGRP 與受體結(jié)合來發(fā)揮作用。研究顯示CGRP 靶向單克隆抗體fremanezumab 并不能阻斷偏頭痛動(dòng)物模型的硬腦膜PPE［19］，但fremanezumab 可通過靶向結(jié)合CGRP 并阻斷其與受體的結(jié)合具備抗偏頭痛的作用。可是也有研究報(bào)道CGRP 受體拮抗劑CGRP（8-37）能阻斷電刺激三叉神經(jīng)節(jié)誘發(fā)的豚鼠硬腦膜PPE［20］；使用NOX-L41 中和CGRP 或BIBN 4096阻斷CGRP 受體也能顯著降低神經(jīng)源性PPE［21］。上述不同的CGRP 靶向藥物對PPE 的作用相反，分析可能與研究設(shè)計(jì)、藥物的分子大小及血腦屏障滲透性不同有關(guān)［22］。

另外，關(guān)于TGVS 激活后硬腦膜PPE 的機(jī)制也有爭議。多數(shù)研究認(rèn)為硬腦膜PPE 主要是由于速激肽（P 物質(zhì)為主）釋放并作用于內(nèi)皮細(xì)胞上的NK1 受體導(dǎo)致毛細(xì)血管后靜脈滲透性增加［3，11，23］，一同釋放的CGRP 可能通過擴(kuò)張血管、進(jìn)一步促進(jìn)P 物質(zhì)釋放及抑制P 物質(zhì)酶降解從而增強(qiáng)了這一病理過程［11，14］。然而有研究發(fā)現(xiàn)NK1 受體拮抗劑和PPE 拮抗劑對偏頭痛無效，因此由P 物質(zhì)∕NK1受體介導(dǎo)的PPE 被認(rèn)為在偏頭痛發(fā)病機(jī)制中并非占主導(dǎo)作用［3］。但也有學(xué)者反駁，偏頭痛發(fā)作一旦發(fā)生，TGVS 已激活，僅抑制PPE 對偏頭痛治療作用并不大［1］。硬腦膜PPE 是偏頭痛動(dòng)物模型成功的一個(gè)重要特征，PPE 在人類偏頭痛中是否存在也有爭議，有研究用視網(wǎng)膜血管造影術(shù)發(fā)現(xiàn)偏頭痛患者急性發(fā)作時(shí)視網(wǎng)膜并無滲出，給予PPE拮抗劑治療無效，推測人類偏頭痛可能不存在PPE［24-25］。然而有學(xué)者利用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像觀察到一例偏頭痛患者在偏頭痛發(fā)作期發(fā)生了顱內(nèi)PPE［26］。因此，PPE 在偏頭痛中的地位、機(jī)制以及抑制PPE 對偏頭痛發(fā)作是否有益仍值得去探討。

綜上所述，硬腦膜PPE 是偏頭痛神經(jīng)源性炎癥的一個(gè)關(guān)鍵特征，本研究初步發(fā)現(xiàn)5-HT7受體可能未參與TGVS 激活誘發(fā)的硬腦膜PPE，這在國內(nèi)外均未見有相關(guān)報(bào)道。基于本課題組已報(bào)道該受體可能參與調(diào)節(jié)TGVS激活誘發(fā)的NDV和CGRP 釋放，筆者認(rèn)為5-HT7受體在偏頭痛中的作用仍值得關(guān)注。未能明確PPE 的具體機(jī)制是本研究不足之處，今后課題組將擴(kuò)大樣本量、擬通過不同類型的偏頭痛動(dòng)物模型和基因敲除模型從多角度進(jìn)一步探討5-HT7受體在偏頭痛神經(jīng)源性炎癥中的作用和機(jī)制。