血紅素氧化酶在膿毒癥大鼠組織中的表達(dá)

張凱 李文軍

西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（西安710016）

目前膿毒癥在全球已成為重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）的首要死亡原因。膿毒癥根據(jù)嚴(yán)重程度分為膿毒癥、膿毒癥休克和嚴(yán)重膿毒癥，其中嚴(yán)重膿毒癥可引發(fā)多器官功能障礙綜合征（MODS），其中臨床常見的為急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征，其主要病理和生理學(xué)特征可引發(fā)頑固低氧血癥和炎癥性肺水腫。血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）屬于抗氧化劑，還是組織細(xì)胞保護(hù)酶，對內(nèi)毒素引發(fā)的急性肺損傷有明顯保護(hù)效果，而HO 可作為反應(yīng)組織氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)［1-2］。其中HO-1 是誘導(dǎo)型同工酶，一般情況下主要存在于血細(xì)胞代謝旺盛的肝、脾、骨髓等組織器官中［3-4］。HO 可將血紅素分解為膽綠素和一氧化碳等，在整個分解過程中，還原輔酶Ⅱ需要為其提供電子，膽綠素則會被還原酶還原至膽紅素［6］。HO-1 也稱為熱休克蛋白，當(dāng)組織或細(xì)胞處于某些應(yīng)激狀態(tài)時，HO-1 能夠承擔(dān)保護(hù)性蛋白的作用被誘導(dǎo)，從而抑制人體內(nèi)由細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的產(chǎn)生，在應(yīng)激狀態(tài)下，很多應(yīng)激成分均能夠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)［6-7］。本研究通過造模膿毒癥肺損傷，探索HO-1 在膿毒癥肺損傷中具體作用和機(jī)制，從而為膿毒癥的診治、早期治療和預(yù)后判斷提供參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料選取40 只大鼠（雄性Wistar），體質(zhì)量（210.02 ± 69.21）g，周齡（8.65 ± 1.35）周，所選擇大鼠均來自于我院動物實(shí)驗(yàn)中心；所有大鼠均給予相同飲用水和飼料進(jìn)食，給予適當(dāng)光照。本實(shí)驗(yàn)已獲得倫理文員會批準(zhǔn)，批號：201803015。

1.2 主要試劑DAB顯色試劑盒：北京中山試劑公司；多聚賴氨酸：北京中山試劑公司；乙醚：天津市化學(xué)試劑三廠；重組人紅細(xì)胞生成素（3 500 IU∕支）：上海實(shí)業(yè)科華生物藥業(yè)有限公司；多聚賴氨酸：北京索來寶科學(xué)技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛：臨沂市泰爾化工科技有限公司；人血紅素氧化酶（HO-1）免疫組化試劑盒（100T）：上海雅吉酶聯(lián)生物科技有限公司。分組：將所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和膿毒癥組，每組20 只。對膿毒癥組進(jìn)行大鼠膿毒癥模型構(gòu)建，而假手術(shù)組僅開腹在縫合的過程，而不進(jìn)行模型構(gòu)建。

1.3 模型構(gòu)建采用CLP 法建立膿毒癥大鼠模型：在模型制作開始前12 h 內(nèi)，禁止大鼠進(jìn)食，可自由飲水，給藥前給予大鼠10%水合氯醛生理鹽水0.3 mL∕100 g，靜脈全麻后對皮膚進(jìn)行常規(guī)消毒，與腹部開2 cm 切口，自腹腔取出盲腸，并采用絲線結(jié)扎盲腸根部。使用9 號注射針頭于盲腸端選取相距3 mm 點(diǎn)處進(jìn)行穿刺，結(jié)束后消毒并包扎傷口。術(shù)后給予大鼠皮下注射5 mL∕100 g 生理鹽水補(bǔ)充術(shù)中體液流失。觀察大鼠在72 h 的存活情況，以72 h 內(nèi)病死率在70%～80%的范圍內(nèi)作為理想的膿毒癥模型。膿毒癥組所有大鼠進(jìn)行以上操作，以制作CLP 大鼠膿毒癥模型；而假手術(shù)組的所有大鼠僅做開關(guān)腹處理。兩組大鼠分別于術(shù)前20 min 及造模后2、6 和12 h 斷頭處死大鼠，開胸取肺組織標(biāo)本，使用10%甲醛溶液固定，固定24 h 后將各組大鼠腦組織自4%多聚甲醛中取出，并切成0.5 cm × 0.5 cm × 1.0 cm 作為組織標(biāo)本。將組織標(biāo)本分別于70%、90%和95%乙醇下脫水，結(jié)束后使用100%乙醇脫水2 次，并采用二甲苯透明標(biāo)本，對組織標(biāo)本行石蠟包埋。取每組標(biāo)本皮質(zhì)部分3 張切片，對其行HE 染色。

1.4 觀察指標(biāo)觀察肺組織的變化情況采用HE染色的方法：將石蠟切片取出，放在60 ℃的溫箱中40 min，然后用二甲苯脫蠟2 次，每次40 min，然后用梯度酒精脫蠟，用自來水清洗片刻，放入蘇木精中直至其變藍(lán)色，之后再用自來水清洗1 min，清洗后使用1%鹽酸酒精分化至紅色后立即使用清水清洗，結(jié)束后放入伊紅中40 s后再次清洗，并采用梯度酒精脫水，在切片上滴入二甲苯，最后用中性樹膠封片，使其自然晾干。HO-1 表達(dá)采用Western印跡法檢測，以actin 作為內(nèi)參照，actin 灰度值比值即為HO-1 蛋白相對表達(dá)量。HO-1mRNA 水平的變化使用Realtime PCR 法：引物合成-提取總RNA-測定RNA 濃度-反轉(zhuǎn)錄合成cDNA-熒光實(shí)時定量PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后掃描，用SD2.0 軟件分析其Ct 值，計(jì)算各標(biāo)本平均Ct 值，Ct=HO-1 Ct 值-actin Ct 值（Ct 值越低，目的基因的相對表達(dá)量越高），計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后2-Ct 值表示mRNA 相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和頻率的方式表示，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化假手術(shù)組大鼠在2、6 h 和12 h 中的肺組織形態(tài)未發(fā)生明顯變化，且未存在明顯病理特征，可清晰觀察到肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和層次，均顯示正常。膿毒癥組肺組織中的病理變化較假手術(shù)組明顯，肺內(nèi)出現(xiàn)了炎癥、水腫和出血等，2 h 時膿毒癥組中的大鼠肺間質(zhì)和肺泡出現(xiàn)了輕度水腫，肺泡間隔有變厚傾向，6 h 時水腫加重，肺泡間隔較之前明顯增厚，且肺部體積明顯增大，顏色變?yōu)榘导t色，肺組織表面還可看到不同程度的充血，且于肺組織邊緣發(fā)現(xiàn)較多肺梗死病灶，12 h 時肺組織病理特征明顯減輕，肺部由暗紅色變?yōu)闇\紅色，仍舊有充血現(xiàn)象，但細(xì)胞水腫現(xiàn)象已有明顯減輕，肺組織邊緣的梗死灶也比6 h 減少。兩組大鼠的具體病理特征見下圖1-4。

圖1 兩組大鼠術(shù)前病理圖片（×400，左為假手術(shù)組，右為膿毒癥組）Fig.1 Preoperative pathological pictures of rats in two groups（×400，sham operation group on the left and sepsis group on the right）

圖2 兩組大鼠手術(shù)后2 h 的病理圖片（×400，左為假手術(shù)組，右為膿毒癥組）Fig.2 Pathological pictures of rats in two groups 2 h after operation（×400，sham operation group on the left and sepsis group on the right）

2.2 Western blot 觀察肺組織HO-1 蛋白比較兩組大鼠在6、12、24 h 體內(nèi)的HO-1 水平，見圖5。圖5 中可發(fā)現(xiàn)在各個時間點(diǎn)膿毒癥組大鼠體內(nèi)的HO-1 印跡顏色均很深，在12 h 時印跡顏色最深，其次為6、24 h 的顏色最淺；而假手術(shù)組在三個時間點(diǎn)的HO-1 印跡顏色均很淺，且與膿毒癥組一樣在12 h 印跡顏色最深，其次為6、24 h 的顏色最淺。說明假手術(shù)組大鼠體內(nèi)的HO-1 表達(dá)水平均顯著比假手術(shù)組高，而兩組大鼠體內(nèi)的HO-1 表達(dá)在12 h 后隨著時間的推遲而逐漸減弱。

圖3 兩組大鼠手術(shù)手6 h 的病理圖片（×400，左為假手術(shù)組，右為膿毒癥組）Fig.3 pathological pictures of rats in two groups at 6 h（×400，sham operation group on the left and sepsis group on the right）

圖4 兩組大鼠手術(shù)12 h 后病理圖片（×400，左為假手術(shù)組，右為膿毒癥組）Fig.4 pathological pictures of rats in two groups after 12 h of operation（×400，sham operation group on the left and sepsis group on the right）

圖5 大鼠肺組織中HO-1 蛋白的表達(dá)Fig.5 expression of HO-1 protein in lung tissue of rats

2.3 觀察不同時間點(diǎn)HO-1 蛋白表達(dá)情況觀察兩組大鼠肺組織HO-1 蛋白OD值，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組的OD值最低，且2、6、12 h 經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；膿毒癥組的OD值在2 h 最低，以后逐漸上升，且3 個時間點(diǎn)內(nèi)OD值對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；膿毒癥組大鼠的OD值均比假手術(shù)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 觀察不同時間點(diǎn)HO-1mRNA表達(dá)的變化兩組大鼠HO-1mRNA 表達(dá)顯示假手術(shù)組OD值最低，且各時間點(diǎn)經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；膿毒癥組OD值在各個時間點(diǎn)均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠肺組織HO-1 蛋白OD 值Tab.1 OD value of HO-1 protein in lung tissue of rats in each group ±s

表1 各組大鼠肺組織HO-1 蛋白OD 值Tab.1 OD value of HO-1 protein in lung tissue of rats in each group ±s

2 h時6間 h點(diǎn)12 ht 值P 值0.027±0.0010.223±0.0050.212±0.008＜0.0011.000 0.131±0.0050.284±0.0070.327±0.0153.1630.002組別假手術(shù)組膿毒癥組t 值P 值例數(shù)20 20-3.018 0.004-2.248 0.022-0.876＜0.001

表2 兩組大鼠HO-1mRNA 表達(dá)OD 值Tab.2 OD values of HO-1 mRNA expression in two groups ±s

表2 兩組大鼠HO-1mRNA 表達(dá)OD 值Tab.2 OD values of HO-1 mRNA expression in two groups ±s

2 h時6間 h點(diǎn)12 ht 值P 值.101±0.2431.250±0.3071.088±0.2461.5190.132.616±0.4121.688±0.3721.679±0.4301.2430.204組別假手術(shù)組膿毒癥組t 值P 值例數(shù)20 20 1 1-8.619＜0.001-5.648＜0.001-8.156＜0.001

3 討論

膿毒癥對患者的身體健康和生命安全都會產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，且部分患者會發(fā)生死亡等不良結(jié)局［8-10］。調(diào)查顯示，全球每年膿毒癥發(fā)生例數(shù)約為1 800 萬，發(fā)生率約為總?cè)丝诘?.3%，且目前每年呈顯著性升高［11-12］。HO 屬于限速酶，對血紅素具有分解和代謝的作用，而HO 受到環(huán)境和藥物因素的影響下易激起細(xì)胞活性，加劇了HO-1 的表達(dá)，對HO-1 行化學(xué)或物理性的刺激時，HO-1 會隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)錄時導(dǎo)致蛋白水平持續(xù)升高［13-14］。結(jié)合最新研究發(fā)現(xiàn)，HO-1 與膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。南川川等［15］發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠模型制備結(jié)束后分別給予HO-1 抑制劑和誘導(dǎo)劑，大鼠血漿中凝血功能出現(xiàn)明顯障礙，游離TM 增加，腎臟TM 表達(dá)明顯降低，且微笑求微血管內(nèi)血栓形成明顯，誘導(dǎo)劑的干預(yù)增加了腎臟TM 的表達(dá)，減輕了炎癥反應(yīng)和降低了游離TM，從而改善了腎臟功能，證實(shí)HO-1 可通過TM 發(fā)揮抗炎和抗凝血作用，從而起到保護(hù)腎臟的作用。

HO-1在分子學(xué)的研究機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，呼吸道疾病等引發(fā)的肺損傷，可導(dǎo)致HO-1 表達(dá)的升高，而其作用機(jī)制對靶細(xì)胞的保護(hù)作用會明顯增強(qiáng)［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)HO-1 屬于一種細(xì)胞保護(hù)性蛋白，在炎性反應(yīng)過程中可抵抗各種有害刺激導(dǎo)致的機(jī)體損傷，且證實(shí)在膿毒癥肝臟、心肌和肺部等靶器官保護(hù)方面發(fā)揮了重要作用［18］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠肺組織整體結(jié)構(gòu)未發(fā)生病理性改變，且肺泡間隔未發(fā)現(xiàn)有增厚跡象，而膿毒癥組大鼠肺組織中發(fā)生了炎癥、出血和水腫等問題，且2 h 時可觀察到肺泡和肺間質(zhì)發(fā)生了輕度水腫，且肺泡間隔有便后跡象，6 h 水腫加重，且肺泡間隔較2 h 明顯增厚，顏色變?yōu)榘导t色，還可與肺組織表面看到不同程度充血現(xiàn)象，12 h 時在肺部組織邊緣發(fā)現(xiàn)很多肺梗死灶再到肺部由暗紅色變?yōu)闇\紅色，仍舊有充血的現(xiàn)象，但細(xì)胞水腫現(xiàn)象已有明顯減輕，肺組織邊緣的梗死灶比6 h 減少。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組大鼠的病理形態(tài)發(fā)生了從輕度到重度再到中度的變化。研究發(fā)現(xiàn)HO-1 源性CO 可增加由絲分裂原激活的蛋白酶活性，且蛋白激酶還可對脂質(zhì)過氧化有明顯抑制作用，除外膽紅素還可抑制蛋白激酶C 和NADPH 氧化酶活性，這可能是HO-1 抑制氧化應(yīng)激作用產(chǎn)生的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中兩組大鼠不同時間點(diǎn)的HO-1 印跡顏色變化為：各個時間點(diǎn)膿毒癥組大鼠體內(nèi)的HO-1 印跡顏色均很深，在12 h 印跡顏色最深，其次為6、24 h 的顏色最淺；而假手術(shù)組在三個時間點(diǎn)的HO-1 印跡顏色均很淺，且與膿毒癥組一樣在12 h 印跡顏色最深，其次為6 h 時，24 h 的顏色最淺。而對兩組大鼠肺組織中HO-1 蛋白的OD值來說，假手術(shù)組也抑制保持平穩(wěn)的狀態(tài)，未發(fā)生明顯變化，而膿毒癥組OD值在2 h 最低，隨著時間延長逐漸上升，且3 個時間點(diǎn)內(nèi)的OD值對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；膿毒癥組大鼠的OD值均比假手術(shù)組高（P＜0.05），說明膿毒癥組大鼠體內(nèi)的HO-1 表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，且大鼠的病理組織學(xué)形態(tài)則隨著HO-1 水平的不斷升高有了明顯的改善情況，證明HO-1 在大鼠體內(nèi)的表達(dá)能夠?qū)δ摱景Y大鼠的肺組織起到明顯的保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，給予烏司他丁后血漿中的炎性細(xì)胞因子IL-6 和IL-8 水平因CLP 造成的升高有所降低，抗炎因子IL-10 大量釋放，增強(qiáng)了組織中的SOD活性，清除了氧自由基，因此考慮到HO-1 mRNA水平的降低與上述細(xì)胞因子調(diào)節(jié)有關(guān)，從而減輕了膿毒癥引發(fā)的急性肺損傷。

本實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：膿毒癥大鼠模型中，膿毒癥組大鼠肺組織中HO-1 的表達(dá)與假手術(shù)組存在明顯差異，膿毒癥組大鼠肺組織中HO-1 的表達(dá)量明顯比假手術(shù)組高，說明了HO-1 對膿毒癥患者肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化有極其密切的關(guān)系；膿毒癥組中肺組織的病理形態(tài)學(xué)損傷隨著肺組織中HO-1 的表達(dá)量的增加而逐漸減輕，說明HO-1 對膿毒癥患者的肺組織病理形態(tài)有明顯的保護(hù)作用和改善效果。