蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡及炎癥因子分泌的調節作用

丁麗宏 耿世佳 王玉杰

1內蒙古醫科大學附屬醫院（呼和浩特 010050）；2內蒙古醫科大學基礎醫學院（呼和浩特 010110）

肺炎鏈球菌為肺炎的主要病原之一，肺炎發生后臨床多表現為打噴嚏、面頰緋紅、流鼻涕、咳痰等，在肺炎發展過程中肺泡上皮細胞凋亡發揮著重要作用，可推動肺炎疾病進展［1-3］。有關研究［4-6］表明，中藥具有價廉、廣譜抗菌、調節免疫等特點，為肺炎的良好治療手段，采用中藥對肺泡上皮細胞凋亡進行抑制可有效防治肺炎鏈球菌肺炎，蟛蜞菊內酯是具有降血脂、抗氧化、抗炎等作用的菊科植物墨旱蓮主要成分之一，蟛蜞菊內酯可通過減輕炎癥細胞浸潤抑制肺泡上皮細胞損傷。本研究以肺泡上皮細胞A549 為研究對象，并以蟛蜞菊內酯為切入點，探究蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡及炎癥因子分泌的調節作用，以期為肺炎鏈球菌感染治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料肺泡上皮細胞A549（中國科學院細胞庫），肺炎鏈球菌（美國ATCC 公司），蟛蜞菊內酯（成都普菲德生物技術有限公司），RPMI-1640 培養基（武漢益普生物科技有限公司），PCR 試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司；KG204］，IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（上海瑤韻生物科技有限公司）。本研究經我院醫學倫理委員會批準（編號：2022-012）。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組肺泡上皮細胞A549 置于RPMI-1640 培養基（100 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的雙抗及10%胎牛血清）中，培養箱（37 ℃、5% CO2）中傳代培養，細胞密度至80% ～ 90%時進行傳代，取3 - 5 代細胞進行后續實驗。取對數生長期A549 細胞，將蟛蜞菊內酯在75 ℃下減壓干燥、稱重，得到Z1、Z2、Z3、Z4 四個子部，TUNEL 法檢測結果顯示，蟛蜞菊內酯對肺泡上皮細胞A549凋亡有不同程度的抑制作用，抑制率隨濃度的增加而增加，呈劑量依賴，作用24 h 后，子部位Z2 的半抑制濃度＞ 100 μmol/L，子部位中Z2、Z3、Z4 的半抑制濃度分別為10、20、40 μmol/L，初篩結果表明，4 個子部位中Z2、Z3、Z4 對肺泡上皮細胞A549凋亡的抑制作用更為明顯，后將其分為感染組（1 × 108/CFU/mL 的肺炎鏈球菌培養細胞）、對照組（不作處理）、感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組（10、20、40 μmol/L 蟛蜞菊內酯預處理，之后采用1 × 108/CFU/mL 的肺炎鏈球菌培養細胞）。

1.2.2 細胞凋亡率檢測細胞凋亡情況通過TUNEL法進行測定，將所培養細胞做洗滌、DAPI 染色封片后的細胞核分別呈現為藍色熒光（陰性細胞數）、綠色熒光（陽性細胞數），之后細胞凋亡情況采用熒光顯微鏡進行觀察，細胞凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。試驗重復測量3 次。

1.2.3 凋亡蛋白表達量檢測通過Western blot（WB）對Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對表達量進行檢測，取細胞上清液，凝膠緩沖液中加入蛋白50 μg，加熱變性。待凝膠電泳后轉膜，取模，在4 ℃的環境下進行1 h封閉處理，加入之后分別加入1∶1 000 TBST 給予稀釋的Bax、Bcl-2、Caspase-3 一抗，4 ℃孵育過夜保存，使用0.05% ～ 0.1% Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween去污劑進行洗膜，使用1∶10 000的二抗在室溫下孵育1 h后TBST洗膜，二氨基聯苯胺顯色，使用Labwork 凝膠圖像掃描所獲得膠片，以β-actin 為內參，計算Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達量。

1.2.4 炎癥因子mRNA 相對表達量檢測IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達量通過實時熒光定量法進行檢測，取細胞上清液，提取細胞總RNA，之后逆轉錄為cDNA，采用Primer 5.0軟件設計引物序列，啟動PCR 儀。IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA表達量通過2-△△Ct方法計算獲得。

1.2.5 炎癥因子水平檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 水平采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法進行測定，取細胞上清液，單抗包被于酶標板上，4 ℃過夜，第2 天采用洗滌緩沖液清洗，共3 次，5 min/次，加入酶標二抗37 ℃ 1 h，采用洗滌緩沖液清洗，共3 次，5 min/次，之后進行顯色，避光孵育30 min，加入終止液，在450 nm 波長下檢測OD值。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析處理。計量資料采用均數±標準差描述，多組間比較采用F檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡情況對比與對照組相比，感染組、感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡率較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染組相比，感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡率較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯中劑量組、高劑量組凋亡率較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯高劑量組凋亡率較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1、圖1。

圖1 細胞凋亡情況對比（Tunel 染色，×200）Fig.1 Comparison of apoptosis among the three groups （Tunel staining，×200）

表1 各組細胞凋亡情況對比（n = 9）Tab.1 Comparison of apoptosis in each group （n = 9）±s，%

表1 各組細胞凋亡情況對比（n = 9）Tab.1 Comparison of apoptosis in each group （n = 9）±s，%

注：與對照組相比，aP ＜ 0.05；與感染組相比，bP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，cP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，dP ＜ 0.05

組別對照組感染組感染+蟛蜞菊內酯低劑量組感染+蟛蜞菊內酯中劑量組感染+蟛蜞菊內酯高劑量組F值P值凋亡率5.86 ± 0.42 32.38 ± 2.90a 23.96 ± 2.45ab 19.27 ± 2.06abc 10.37 ± 1.10abcd 11.490 0.001

2.2 各組細胞凋亡相關蛋白表達量對比與對照組相比，感染組、感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組Bax、Caspase-3 蛋白表達量較高，Bcl-2 蛋白表達量較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染組相比，感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組Bax、Caspase-3 蛋白表達量較低，Bcl-2 蛋白表達量較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯中劑量組、高劑量組Bax、Caspase-3 蛋白表達量較低，Bcl-2 蛋白表達量較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯高劑量組Bax、Caspase-3 蛋白表達量較低，Bcl-2 蛋白表達量較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2、圖2。

圖2 細胞凋亡相關蛋白WB 圖Fig.2 WB diagram of apoptosis-related protein

表2 各組細胞凋亡相關蛋白表達量對比（n = 9）Tab.2 Comparison of apoptosis-related protein expression levels in all groups （n = 9） ±s

表2 各組細胞凋亡相關蛋白表達量對比（n = 9）Tab.2 Comparison of apoptosis-related protein expression levels in all groups （n = 9） ±s

注：與對照組相比，aP ＜ 0.05；與感染組相比，bP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，cP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，dP ＜ 0.05

組別對照組感染組感染+蟛蜞菊內酯低劑量組感染+蟛蜞菊內酯中劑量組感染+蟛蜞菊內酯高劑量組F值P值Caspase-3 0.21 ± 0.03 0.82 ± 0.14a 0.71 ± 0.11ab 0.58 ± 0.06abc 0.40 ± 0.05abcd 9.775 0.001 Bax 0.29 ± 0.04 0.76 ± 0.12a 0.68 ± 0.09ab 0.60 ± 0.06abc 0.38 ± 0.05abcd 4.217 0.001 Bcl-2 0.82 ± 0.11 0.30 ± 0.06a 0.41 ± 0.07ab 0.52 ± 0.09abc 0.70 ± 0.10abcd 2.422 0.028

2.3 各組細胞炎癥因子mRNA 相對表達量與對照組相比，感染組、感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達量較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染組相比，感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達量較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯中劑量組、高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達量較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達量較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 各組細胞炎癥因子mRNA 相對表達量（n = 9）Tab.3 Relative mRNA expression levels of inflammatory factors in each group （n = 9） ±s

表3 各組細胞炎癥因子mRNA 相對表達量（n = 9）Tab.3 Relative mRNA expression levels of inflammatory factors in each group （n = 9） ±s

注：與對照組相比，aP ＜ 0.05；與感染組相比，bP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，cP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，dP ＜ 0.05

組別對照組感染組感染+蟛蜞菊內酯低劑量組感染+蟛蜞菊內酯中劑量組感染+蟛蜞菊內酯高劑量組F值P值TNF-α 1.00 ± 0.01 2.25 ± 0.31a 1.78 ± 0.21ab 1.66 ± 0.19abc 1.30 ± 0.14abcd 6.412 0.001 IL-6 1.00 ± 0.01 2.13 ± 0.23a 1.80 ± 0.19ab 1.65 ± 0.15abc 1.23 ± 0.11abcd 6.247 0.001 IL-1β 1.00 ± 0.01 2.20 ± 0.30a 1.76 ± 0.20ab 1.63 ± 0.18abc 1.25 ± 0.12abcd 6.228 0.001

2.4 各組細胞炎癥因子水平對比與對照組相比，感染組、感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染組相比，感染+蟛蜞菊內酯低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯中劑量組、高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α 水平較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，感染+蟛蜞菊內酯高劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達量較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表4。

表4 各組細胞炎癥因子水平對比（n = 9）Tab.4 Comparison of levels of inflammatory cytokines in each group（n = 9） ±s

表4 各組細胞炎癥因子水平對比（n = 9）Tab.4 Comparison of levels of inflammatory cytokines in each group（n = 9） ±s

注：與對照組相比，aP ＜ 0.05；與感染組相比，bP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯低劑量組相比，cP ＜ 0.05；與感染+蟛蜞菊內酯中劑量組相比，dP ＜ 0.05

TNF-α（ng/mL）9.12 ± 1.03 59.06 ± 10.37a 50.31 ± 8.06ab 41.56 ± 7.24abc 23.16 ± 3.45abcd 11.700 0.001組別對照組感染組感染+蟛蜞菊內酯低劑量組感染+蟛蜞菊內酯中劑量組感染+蟛蜞菊內酯高劑量組F值P值IL-6（pg/mL）81.26 ± 9.45 368.45 ± 50.21a 300.41 ± 42.27ab 221.39 ± 36.24abc 154.37 ± 21.76abcd 9.245 0.001 IL-1β（pg/mL）21.39 ± 3.06 80.46 ± 10.03a 62.89 ± 7.26ab 50.30 ± 5.90abc 40.27 ± 4.96abcd 9.719 0.001

3 討論

肺泡上皮細胞對肺泡表面張力具有調節作用，且可通過合成、分泌細胞因子參與肺部炎癥反應，自然界中肺炎鏈球菌感染廣泛存在，感染后可造成肺泡上皮細胞分泌炎癥因子及凋亡，進而加重了肺部炎癥反應，最終推動了疾病進展［7-9］。

蟛蜞菊內酯是由蟛蜞菊、墨旱蓮等植物提取獲得的香豆草草醚類化合物，具有清熱解毒涼血散淤、抗炎、抗免疫抑制等作用，在毒蛇咬傷、膿毒性休克、肝疾病的治療中均有應用［10］。蟛蜞菊內酯具有易于合成、生物活性多樣、生物利用度高的優點，對細胞凋亡、炎癥應答具有介導作用的Caspase 具有抑制作用［11-12］。本研究發現，肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞采用不同濃度蟛蜞菊內酯進行處理后細胞凋亡率、Bax、Caspase-3 表達量、促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平下降，Bcl-2 表達量升高，且呈濃度依賴，表明蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞炎癥反應、凋亡具有劑量依賴性的抑制作用，可減輕肺泡上皮細胞損傷。

有研究［13-15］發現，細胞凋亡過程中涉及死亡受體、線粒體信號通路，其中Bax/Bcl-2 作為線粒體信號通路的一種，在細胞凋亡中發揮著重要作用，Bcl-2 對細胞凋亡具有抵抗作用，而Bax 在促進細胞凋亡的同時可拮抗Bcl-2，正常情況下Bax 在細胞胞漿中以單體形式存在，當其轉移至線粒體膜后結合Bcl-2，形成異二聚體，進而對細胞凋亡起到了促進作用。Caspase-3 經細胞凋亡信號刺激后被激活，進而形成了凋亡級聯反應，誘導了不可逆凋亡的發生［16］。肺泡上皮細胞在肺炎鏈球菌感染后出現結構、功能變化，局部生理機能下降或喪失，凋亡增加，隨肺泡上皮細胞凋亡的增加機體抗感染能力降低、細胞防御功能喪失，蟛蜞菊內酯對Caspase 具有抑制作用，使得細胞凋亡率下降［17-18］。本研究發現，肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞經蟛蜞菊內酯干預后Bcl-2 表達量升高，Bax、Caspase-3 表達量降低，表明蟛蜞菊內酯對肺泡上皮細胞凋亡具有抑制作用。

誘導物、炎癥介質、傳感器、靶細胞/組織為炎癥發生的構成部分，其中IL-6、IL-1β、TNF-α 均為炎癥介質，可造成組織炎癥，引發或加重組織損傷［19-20］。NF-κB 途徑在免疫應答、炎癥反應中具有重要作用，可響應細胞外界促炎因子、病毒、輻射等刺激，釋放后進入細胞核，促進IL-6、IL-1β、TNF-α 表達，而蟛蜞菊內酯對NF-κB 信號通路活化具有抑制作用，進而抑制了炎癥因子表達，發揮了抗炎作用［21-22］。本研究發現，蟛蜞菊內酯可降低肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞IL-6、IL-1β、TNF-α 分泌量，提示蟛蜞菊內酯對炎癥因子分泌具有抑制作用，進而減輕了組織損傷，這與黃川鋒等［23］研究結果相似。

綜上所述，蟛蜞菊內酯可有效抑制肺泡上皮細胞的凋亡、炎癥因子分泌，為臨床上治療肺炎鏈球菌肺炎提供理論依據，但蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌肺炎肺泡上皮細胞的保護機制有待進一步探討，以此為肺炎鏈球菌肺炎臨床治療提供新的方法和思路。