阿托伐他汀對(duì)阿霉素腎病大鼠氧化應(yīng)激及klotho蛋白表達(dá)的影響

[摘要] 目的 研究阿托伐他汀對(duì)阿霉素腎病大鼠的保護(hù)作用，探討其機(jī)制是否與氧化應(yīng)激及klotho蛋白表達(dá)相關(guān)。

方法 Wistar大鼠尾靜脈注射阿霉素（10 mg/kg）進(jìn)行造模處理，造模成功后，分為模型組和干預(yù)組各18只。未造模大鼠標(biāo)記為對(duì)照組。對(duì)照組及模型組大鼠每天用生理鹽水1 mL/kg灌胃，干預(yù)組每天用阿托伐他汀10 mg/kg灌胃，持續(xù)12周。分別于第4、8、12周測(cè)定24 h尿蛋白定量及血清清蛋白水平，同時(shí)處死大鼠取腎，進(jìn)行腎組織病理學(xué)觀察，并測(cè)定腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)水平和總抗氧化能力（T-AOC），用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)klotho蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)klotho mRNA表達(dá)。

結(jié)果 模型組、干預(yù)組大鼠24 h尿蛋白定量高于對(duì)照組，干預(yù)組低于模型組，差異具有顯著意義（F=242.285～1 412.89，P<0.05）。模型組、干預(yù)組大鼠血清清蛋白水平低于對(duì)照組，干預(yù)組高于模型組，差異具有顯著性（F=58.265～240.54，P<0.05）。蘇木精-伊紅染色觀察顯示，相較于模型組，干預(yù)組大鼠腎小球病變減輕，腎小管細(xì)胞水腫程度降低。模型組大鼠腎組織MDA水平較對(duì)照組明顯升高，而干預(yù)組較模型組明顯降低（F=20.43～161.64，P<0.05）;干預(yù)組大鼠腎組織SOD、T-AOC水平均高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.97～604.10，P<0.05）。模型組和干預(yù)組大鼠腎組織klotho mRNA及klotho蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低，而干預(yù)組較模型組表達(dá)升高，差異具有顯著性（F=173.88～964.23，P<0.05）。

結(jié)論 阿托伐他汀可以延緩阿霉素腎病大鼠的腎臟疾病進(jìn)展，減輕氧化應(yīng)激損傷，機(jī)制可能與上調(diào)klotho蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 阿托伐他汀;腎病;多柔比星;氧化性應(yīng)激;klotho蛋白

[中圖分類(lèi)號(hào)] R972.6;R692

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）03-0450-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.020

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200806.1723.003.html;2020-08-07 11：24：54

EFFECT OF ATORVASTATIN ON OXIDATIVE STRESS AND KLOTHO PROTEIN EXPRESSION IN RATS WITH ADRIAMYCIN NEPHROPATHY

WANG Cheng， LIU Liqiu

（Department of Nephrology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the protective effect of atorvastatin on rats with adriamycin nephropathy and whether its possible mechanism is associated with oxidative stress and the expression of klotho protein.

Methods Wistar rats were given tail vein injection of adriamycin （10 mg/kg） to establish a model， and after successful modeling， the rats were divided into model group and intervention group， with 18 rats in each group. Unmodeled rats were selected as control group. The rats in the control group and the model group were given normal saline 1 mL/kg per day by gavage， and those in the intervention group were given atorvastatin 10 mg/kg per day by gavage， for 12 consecutive weeks. At weeks 4， 8， and 12 of intervention， 24 h urinary protein and serum albumin were measured， and the rats were sacrificed to collect the kidney for renal histopathological observation and measurement of the expression levels of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity （T-AOC） in renal tissue. Western blot was used to measure the protein expression of klotho， and quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to measure the mRNA expression of klotho.

Results The model group and the intervention group had significantly higher 24 h urinary protein than the control group， and the intervention group had significantly lower 24 h urinary protein than the model group （F=242.285-1 412.89，Plt;0.05）. The model group and the intervention group had a significantly lower se-rum level of albumin than the control group， and the intervention group had a significantly higher level than the model group （F=58.265-240.54，Plt;0.05）. Hematoxylin and eosin staining showed that compared with the model group， the intervention group had significant alleviation of glomerular lesions and a significant reduction in the degree of tubular cell edema. The model group had a significantly higher level of MDA in renal tissue than the control group， while the intervention group had a significantly lower level than the model group （F=20.43-161.64，Plt;0.05）， and compared with the model group， the intervention group had significantly hig-her levels of SOD and T-AOC in renal tissue （F=4.97-604.10，Plt;0.05）. The model group and the intervention group had significantly lower mRNA and protein expression of klotho than the control group， while the intervention group had significantly higher expression than the model group （F=173.88-964.23，Plt;0.05）.

Conclusion Atorvastatin may delay the progression of nephropathy and reduce oxidative stress injury in rats with adriamycin nephropathy， possibly by upregulating the protein expression of klotho.

[KEY WORDS]atorvastatin; adriamycin nephrosis; doxorubicin; oxidative stress; klotho protein

作為一種公認(rèn)的可以模擬腎病綜合征的模型，阿霉素腎病具體機(jī)制尚不完全明確，其病理變化與人類(lèi)腎病綜合征相類(lèi)似。作為一種抗腫瘤藥物，由于具有多器官毒性，特別是腎臟毒性，阿霉素在臨床中的應(yīng)用被大大限制[1]。阿霉素誘導(dǎo)毒性的分子機(jī)制是多因素的，至今沒(méi)有完全確定。到目前為止，最被接受的理論之一是它與氧化應(yīng)激有關(guān)[2]。作為一種耐受性良好的降脂他汀類(lèi)藥物，阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化等作用。已有研究表明，他汀類(lèi)藥物可以有效改善阿霉素引起的心臟毒性[3]。但是，阿托伐他汀對(duì)阿霉素引起的腎臟毒性的保護(hù)作用尚存在爭(zhēng)議[4]。Klotho蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化、抑制纖維化、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物學(xué)作用，對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激也具有保護(hù)作用[5]?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀，本研究對(duì)阿霉素腎病大鼠進(jìn)行不同時(shí)間的阿托伐他汀干預(yù)，檢測(cè)大鼠腎病進(jìn)展情況，并檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和總抗氧化能力（T-AOC）以及klotho蛋白的變化情況，探討阿托伐他汀對(duì)阿霉素腎病大鼠的保護(hù)作用及其對(duì)腎臟氧化應(yīng)激和klotho蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性Wistar大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量（250±15）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物房。阿霉素購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express，阿托伐他汀鈣片（立普妥，每片20 mg）購(gòu)自輝瑞制藥有限公司。MDA、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，T-AOC試劑盒購(gòu)自凱基生物公司，klotho抗體購(gòu)自北京博奧森生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿霉素腎病大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)選取20只作為對(duì)照組，其余40只大鼠給予尾靜脈注射阿霉素10 mg/kg進(jìn)行造模處理，對(duì)照組給予等量生理鹽水。1周后檢測(cè)大鼠24 h尿蛋白，與對(duì)照組大鼠相比，尿蛋白升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義視為造模成功。造模過(guò)程中有4只大鼠死亡。將剩余36只大鼠隨機(jī)分為模型組和干預(yù)組，每組18只。干預(yù)組大鼠每天給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃處理，模型組及對(duì)照組大鼠每天給予1 mL/kg的生理鹽水灌胃處理，持續(xù)12周。每周稱(chēng)體質(zhì)量1次，以調(diào)節(jié)藥物劑量。

1.2.2 24 h尿蛋白檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)第4、8、12周，從每組隨機(jī)各取6只大鼠放入清潔代謝籠中，留取24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 腎臟標(biāo)本的制備及血清清蛋白檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)第4、8、12周，每組隨機(jī)各取6只大鼠。麻醉后，切取一側(cè)腎臟，-80 ℃保存;另一側(cè)腎臟置于40 g/L中性甲醛溶液中固定，待制備石蠟切片后進(jìn)行腎組織病理學(xué)觀察。同時(shí)于心臟取血，以4 000 r/min高速離心，取血清用溴甲酚綠法檢測(cè)清蛋白水平。

1.2.4 腎組織病理學(xué)觀察 取出固定的腎臟組織，石蠟包埋后制備3 μm厚度切片。對(duì)切片進(jìn)行二甲苯脫蠟處理，乙醇水洗，蘇木精染色，自來(lái)水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水浸泡，伊紅染色，常規(guī)脫水、透明、封片。用光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯BX51TF）對(duì)染色切片進(jìn)行觀察分析。

1.2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 采用脂質(zhì)過(guò)氧化比色試劑盒測(cè)定大鼠腎組織MDA水平，采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測(cè)定SOD水平，使用722分光光度計(jì)通過(guò)比色測(cè)定T-AOC。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)klotho mRNA 用Trizol提取總RNA，用第一鏈cDNA合成試劑盒從2 μg總RNA中合成第一鏈cDNA。用SYBR Green PCR試劑在ABI 7500型熒光定量PCR儀中，以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行定量PCR。引物由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。Klotho-F引物序列為5′-TTTGCCCTATTT-CACCGAAG-3′，klotho-R引物序列為5′-CCTGA-CTGGGAGAGTTGAGC-3′。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)klotho蛋白 從大鼠腎組織中提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行Western Blot分析。制備SDS-PAGE 凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜，加一抗和二抗進(jìn)行抗體反應(yīng)，曝光顯影，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組比較，然后采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較;相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearson相關(guān)分析。

2 結(jié)" 果

2.1 造模后大鼠一般狀況

大鼠尾靜脈注射阿霉素1周后均出現(xiàn)不同程度腹瀉、食欲減退、消瘦、活動(dòng)減少等表現(xiàn);2周后出現(xiàn)輕度水腫，以睪丸及足部最為明顯。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清清蛋白比較

隨時(shí)間延長(zhǎng)，模型組和干預(yù)組大鼠24 h尿蛋白定量進(jìn)行性升高。實(shí)驗(yàn)第4、8、12周時(shí)，模型組、干預(yù)組大鼠24 h尿蛋白定量高于對(duì)照組，干預(yù)組低于模型組，差異具有顯著性（F=242.285～1 412.89，P<0.05）。模型組、干預(yù)組大鼠血清清蛋白水平低于對(duì)照組，而干預(yù)組高于模型組，差異具有顯著意義（F=58.265～240.54，P<0.05）。見(jiàn)表1、2。

2.3 腎組織病理學(xué)觀察

大體觀察顯示：對(duì)照組大鼠腎臟外觀紅潤(rùn);模型組大鼠腎臟腫大，包膜緊張，外觀蒼白;干預(yù)組大鼠腎臟輕度腫大，顏色輕度暗淡，略有光澤。對(duì)大鼠腎臟進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察可見(jiàn)：模型組腎小球右側(cè)小管區(qū)無(wú)結(jié)構(gòu)、壞死，腎小管上皮細(xì)胞水腫，部分壞死、無(wú)核，管腔狹窄;干預(yù)組腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕，壞死程度及范圍均小于模型組，細(xì)胞核損傷程度低于模型組。

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

隨時(shí)間推移，模型組大鼠腎組織MDA水平逐漸升高，干預(yù)組則逐漸降低;而SOD及T-AOC的變化趨勢(shì)與MDA相反。組間比較，模型組大鼠腎組織MDA水平較對(duì)照組明顯升高，而干預(yù)組較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.43～161.64，P<0.05）;干預(yù)組大鼠腎組織SOD、T-AOC水平均高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.97～604.10，P<0.05）。見(jiàn)表3～5。

2.5 各組大鼠klotho mRNA表達(dá)比較

模型組和干預(yù)組大鼠腎組織klotho mRNA表達(dá)較對(duì)照組降低，而干預(yù)組表達(dá)較模型組升高，差異有顯著性（F=253.21～964.23，P<0.05）。見(jiàn)表6。

2.6 各組大鼠klotho蛋白表達(dá)比較

模型組大鼠腎組織klotho蛋白的表達(dá)隨時(shí)間推移而降低，但干預(yù)組大鼠腎組織klotho蛋白的表達(dá)隨時(shí)間推移而升高。組間比較，模型組和干預(yù)組大鼠腎組織klotho蛋白較對(duì)照組表達(dá)降低，而干預(yù)組較模型組表達(dá)升高，差異均具有顯著意義（F=173.88～821.60，P<0.05）。見(jiàn)表7。

2.7 klotho蛋白表達(dá)與氧化應(yīng)激指標(biāo)關(guān)系

大鼠腎組織klotho蛋白表達(dá)與MDA含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.728，P<0.05），與SOD含量和T-AOC水平呈正相關(guān)（r=0.323、0.539，P<0.05）。見(jiàn)圖1。

3 討" 論

阿霉素腎病模型是目前公認(rèn)的腎病綜合征動(dòng)物模型，其發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用阿霉素進(jìn)行造模，通過(guò)檢測(cè)大鼠24 h尿蛋白定量及血清清蛋白顯示，阿托伐他汀可降低阿霉素腎病大鼠尿蛋白水平，并一定程度提高血清清蛋白水平，且HE染色顯示，干預(yù)組病變較模型組減輕，這提示阿托伐他汀可改善阿霉素腎病的病理?yè)p害。

在阿霉素腎病模型中，氧化應(yīng)激是常見(jiàn)及重要的機(jī)制之一。MDA可間接反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)阿霉素造模處理后，模型組大鼠腎組織中MDA含量明顯升高，且隨時(shí)間推移逐漸增高。這是因?yàn)榘⒚顾啬I病在無(wú)藥物治療情況下，會(huì)隨著時(shí)間推移而不斷進(jìn)展惡化，所以MDA含量會(huì)持續(xù)升高。而經(jīng)過(guò)阿托伐他汀干預(yù)后，干預(yù)組MDA含量較模型組降低，并且隨時(shí)間推移而降低，表明阿托伐他汀可抑制氧化應(yīng)激。這與有關(guān)研究結(jié)果相吻合[6]。SOD可以在分子、細(xì)胞水平防止和減輕機(jī)體組分受到過(guò)氧化損傷。Klotho蛋白可通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）受體結(jié)合，增強(qiáng)SOD活性[7]。在阿霉素腎病中SOD活性受到抑制，故其清除氧自由基的作用明顯降低，氧自由基含量進(jìn)一步升高[8]。阿霉素降低主動(dòng)脈和腎臟SOD的表達(dá)，可能是氧化應(yīng)激增強(qiáng)的原因之一。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠腎組織SOD的表達(dá)持續(xù)降低，與TAKENAKA等[9]的研究結(jié)果相一致。在抗氧化能力評(píng)估中，T-AOC測(cè)量比單個(gè)抗氧化劑濃度測(cè)量更為可靠[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素會(huì)影響正常大鼠的抗氧化能力，而阿托伐他汀則會(huì)改善阿霉素腎病大鼠減弱的抗氧化能力。

Klotho蛋白由腎小管分泌，從間質(zhì)進(jìn)入Bowman囊和足細(xì)胞[11]。Klotho蛋白在腎臟中的表達(dá)水平最高[12]，它參與腎臟離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)，以及腎臟1，25-二羥維生素D3的生成調(diào)節(jié)[13]。Klotho蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用[14]，它通過(guò)抗炎癥、氧化應(yīng)激和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）[15]，發(fā)揮對(duì)阿霉素腎病的保護(hù)作用。阿霉素腎病的發(fā)展可能與klotho的表達(dá)降低有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，阿托伐他汀會(huì)上調(diào)klotho蛋白在阿霉素腎病狀態(tài)下表達(dá)。Klotho表達(dá)的調(diào)節(jié)可能與Rho通路有關(guān)。有研究表明，阿托伐他汀可以增強(qiáng)klotho基因的表達(dá)[16]。YOON等[17]研究認(rèn)為，抑制Rho及其下游靶點(diǎn)Rho激酶也可能是他汀類(lèi)藥物發(fā)揮作用的機(jī)制之一。他汀類(lèi)藥物可通過(guò)RhoA滅活大鼠內(nèi)髓質(zhì)集合管上皮細(xì)胞，從而上調(diào)klotho mRNA的表達(dá)。Klotho蛋白在腎病綜合征病人體內(nèi)水平的變化與氧化/抗氧化失衡有密切聯(lián)系，其表達(dá)水平下降可能是腎臟氧化損傷加重的原因之一。在氧化應(yīng)激情況下，klotho可通過(guò)上調(diào)熱休克蛋白70（HSP70）表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)[18]。所以，誘導(dǎo)klotho基因表達(dá)可以挽救氧化應(yīng)激所造成的腎組織損傷，而阿托伐他汀可能通過(guò)增強(qiáng)klotho的表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用。

目前認(rèn)為免疫反應(yīng)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，所以抗炎、抑制免疫治療是當(dāng)前許多腎病的主要治療方法。糖皮質(zhì)激素是現(xiàn)今應(yīng)用最為廣泛的免疫-炎癥抑制劑，但在臨床上經(jīng)常會(huì)遇到糖皮質(zhì)激素依賴(lài)或糖皮質(zhì)激素抵抗，目前尚無(wú)好的解決方法。過(guò)去人們比較關(guān)注他汀類(lèi)藥物通過(guò)發(fā)揮降脂作用保護(hù)腎臟，近年來(lái)越來(lái)越多地關(guān)注他汀類(lèi)藥物的抗炎、免疫調(diào)節(jié)等非降脂腎臟保護(hù)作用。他汀類(lèi)藥物能夠改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制腎小球的增生肥大和腎小球系膜細(xì)胞增殖，并抑制系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、血管緊張素Ⅱ的表達(dá)和分泌，從而減少病人尿蛋白排泄量，改善其腎功能[19]。但是本實(shí)驗(yàn)還顯示，阿托伐他汀可以調(diào)節(jié)腎臟中關(guān)鍵基因蛋白klotho的表達(dá)，改善阿霉素腎病的病理狀況，緩解其氧化應(yīng)激損傷，這為臨床上治療腎病綜合征提供了思路。但是本實(shí)驗(yàn)還存在一定的不足，如樣本量小、確切機(jī)制未研究清楚，還需要進(jìn)一步研究以得到更加確切的結(jié)論。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿托伐他汀可以延緩并改善阿霉素腎病大鼠腎臟病理?yè)p害。阿霉素腎病大鼠腎臟受到氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA、SOD及T-AOC異常表達(dá)，阿托伐他汀可一定程度糾正氧化應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)腎臟中klotho蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（本文編輯 馬偉平）