赤松混交林枯梢病不同病級針葉內部細菌多樣性研究

謝 憲，梁 軍,＊，朱彥鵬，時 良，高 燕，張 銘，程 元，張星耀,

(1. 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所 國家林業和草原局森林保護學重點實驗室，北京 100091；2. 昆崳山森林生態系統國家定位觀測研究站，山東 煙臺 264100；3. 中國環境科學研究院，北京 100012)

松枯梢病是世界范圍內針葉樹上最常見和分布最廣的重要病害之一。枯梢病病原菌為松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea(Fr.) Dyko & B. Sutton.），病菌侵染主要從寄主傷口處侵入，1997 年Stanosz 對Pinus resinosaLoisel.和北美短葉松（Pinus banksianaLambert.）的研究中首次發現無病斑的嫩梢上存在潛伏侵染[1]。劉艷在多個松屬樹種套袋隔離的實驗中，發現冬季表面無病斑的梢上存在松枯梢病菌定殖的情況，來年可造成春梢發病[2]。松枯梢病已在我國10 余個省份的松林中發生，對松樹人工林造成了嚴重的危害，損失巨大，已列入我國重要的森林病害進行研究。

植物內生細菌在其生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官內部，并與植物建立和諧聯合關系。隨著對植物內生細菌在促進植物生長、生物控制和緩解脅迫等方面的深入研究[3]，寄主植物內生細菌與病害的研究也越來越受到關注。內生細菌通過多種機制共同作用從而減輕或防止有害致病微生物對寄主的影響[4]，機制包括抗生（代謝物質生產）、生長促進、誘導宿主防御（誘導系統抗性）、寄生、競爭和信號干擾（群體感應）[5]。內生細菌通過生物固氮、加速消化、增磷和產生植物激素直接作用于植物的生長發育，從而產生對生物因子的抗性[6]。松枯梢病作為真菌病害，在其拮抗細菌方面已有相關研究，如通過對健康及染病針葉的內生細菌進行分離培養，獲得具有生防潛力的內生細菌[7]，但關于枯梢病菌對松樹內生細菌多樣性及群落結構的影響方面未見相關研究。

昆崳山是赤松（Pinus densifloraSieb. et Zucc.）的原生地和天然分布中心，與黑松（Pinus thunbergiiParl.）、麻櫟（Quercus acutissimaCarruth.）等共組成地帶性天然次生林植被。為探究混交林中枯梢病對寄主內生細菌的影響，選取典型混交林型針闊混交林（赤松-麻櫟）和針葉混交林（赤松-黑松），測定兩種混交林中赤松針葉內生細菌的變化，探明不同枯梢病發病狀態下赤松針葉的內生細菌多樣性及群落結構，分析內生細菌的多樣性及群落結構差異，為松枯梢病的細菌群落結構調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況及樣地設置

昆崳山（121°41′34″～121°48′04″ N，37°11′50″～37°17′49″ E）地處山東半島東部，屬暖溫帶季風氣候，林區土壤屬森林棕壤，以沙質壤土為主。昆崳山是我國和東北亞赤松原生地和天然分布中心，赤松在該區域與黑松、麻櫟等共同組成地帶性天然次生林植被。

共選取6 塊30 m × 30 m 樣地，其中3 塊樣地林分結構為針闊混交林，由赤松以及麻櫟構成，其中赤松占比52%～59%，海拔為210 ± 70 m，地理坐標為121°43′35.0″ E，37°17′30.9″ N；121°45′08.4″ E，37°17′37.8″ N；121°43′19″ E，37°17′30.2″ N。另3 塊為針葉混交林，由赤松以及黑松構成，其中赤松占比46%～49%，海拔為360 ± 30 m，地理坐標為121°45′32.60″ E，37°16′3.06″ N；121°45′33.16″ E，37°15′57.94″ N；121°45′37.55″ E，37°15′52.17″ N。樣地立地條件均為中坡位，坡度為23° ± 3°，坡向為東南半陽坡。

1.2 樣品采集

于2018 年9 月在3 塊針闊混交林樣地內分別采集ZK1（全株無病斑赤松的針葉）、ZK2（染病赤松上無病斑針葉）、ZK3（染病較輕針葉，病斑長度為針葉長度二分之一以下）、ZK4（染病較重針葉，病斑長度為針葉長度二分之一以上）；在3 塊針葉混交林樣地內分別采樣CZ1（全株無病斑赤松的針葉）、CZ2（染病赤松上無病斑針葉）、CZ3（病斑長度為針葉長度二分之一以下）、CZ4（病斑長度為針葉長度二分之一以上）。采用五點取樣法（在樣地內四角及對角線中心處選樹，每個樣點選取一株染病赤松和一株全株無病斑赤松）采集樣本，針葉取自赤松上冠層，每個樣點各采集二年生針葉8 束，各類針葉分別采集針葉40束，并進行表面消毒處理。無菌水沖洗并晾干后，用75% 乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3 次，0.5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min 后，再用無菌水沖洗3 次，將最后一次沖洗后的無菌水稀釋至LB 培養基上進行培養，3 d 后觀察結果，針葉外表無細菌殘留，證實針葉表面已滅菌。

1.3 內生細菌多樣性測定

使用高通量測序技術對針葉內生細菌多樣性進行測定。首先利用CTAB 法對樣本DNA 進行抽提，完成后將DNA 樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop 檢測質量合格后，取30 ng 進行PCR 擴增[8]。PCR 擴增體系：DNA 樣品，1.0 μL；Forward Primer（5.0 μmol·L-1），1.0 μL；Reverse Primer（5.0 μmol·L-1），1.0 μL；BSA（2.0 ng·μL-1），3.0 μL；2 × Taq Plus Master Mix，12.5 μL；ddH2O，6.5 μL。進行16S V3-V4 區基因擴增，16S V3-V4區擴增引物序列為（5′-GTACTCCTACGGGAGG CAGCA-3′）和（5′-GTGGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′）。

PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，將PCR 產物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。擴增產物采用Illumina Miseq PE300 平臺，并構建Miseq 文庫以及Miseq上機測序。

1.4 測序數據處理與分析

OTU（operational taxonomic units）是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，為某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的同一標志。用uclust（Version 1.2.22）按照97%相似性將全部序列聚類，去除singleton 的OTU，同時去除注釋為葉綠體、線粒體的序列，并得到代表序列和OTU 表。用usearch 按照97% 相似性序列進行OTU 聚類，得到代表序列再將其全部序列按照97% 相似度比對到OTU 上形成OTU 列表，使用Mothur 軟件計算豐富度指數Chao1 和多樣性指數Shannon[9]。使用R 軟件（v2.15.3）繪制主成分分析圖。測序數據已上傳NCBI，編號為SUB 5584140。

2 結果與分析

2.1 操作分類單元（OTU）及其多樣性分析

測序結果顯示，在針闊混交林ZK 的12 個樣品中共獲得細菌有效序列388 587 條，共計679 個OTU；在針葉混交林CZ 的12 個樣品共獲得細菌有效序列336 600 條，共計656 個OTU。各樣品Coverage 測序深度指數統計分析結果見表1，結果顯示采集針葉樣本中覆蓋率均接近于99%，且圖1稀釋曲線趨勢平緩，說明各樣本中的細菌物種信息被充分檢測，結果能夠代表各類針葉中細菌的真實水平。

根據內生細菌OTU 數目，對樣品中OTU 組成進行分析，構建Venn 圖（圖2）和群落結構柱狀圖（圖3，4，5）。根據圖2a，在針闊混交林ZK 中不同染病程度的針葉中共有相同的OTU 83個，占OTU 總數的12.22%，4 類針葉中特有的OTU 數目分別為90、69、59、25 個，以ZK1 中特有OTU 數目最多。根據圖2b，在針葉混交林CZ中不同染病程度的針葉中共有相同的OTU 69 個，占OTU 總數的10.51%，4 類針葉中特有的OTU數目分別為120、79、66、45 個，同樣以CZ1 中特有OTU 數目最多。

表1 不同染病情況的赤松針葉內細菌豐富度與多樣性指數Table1 Abundance and diversity of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora

圖1 針葉內部細菌OTU 稀釋曲線圖（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 1 OTU-based rarefaction curves of bacteria in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-l eaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

樣本內細菌的Chao1 指數和Shannon 指數統計分析結果見表1，針闊混交林與針葉混交林中的內生細菌多樣性及豐度呈現相同的變化趨勢。無病斑赤松針葉內生細菌的Chao1 和Shannon 指數最高，即測得OTU 數與種類數均最高，其次分別為染病赤松上的無病斑針葉、病斑長度為針葉長度二分之一以下的赤松針葉、病斑長度為針葉長度二分之一以上的赤松針葉，隨著病菌侵染的加重，內生細菌豐富度及多樣性呈現出下降的趨勢。

圖2 不同染病情況下赤松針葉內細菌操作單元（OTU）分類Venn 圖（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 2 Venn diagram of OTU distribution of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

圖3 不同病害侵染狀態下赤松針葉內部細菌門水平組成（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 3 Bacterial phyla from endosphere bacteria of different level of disease in the needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

2.2 細菌門水平的優勢類群組成分析

圖4 不同病害侵染狀態下赤松針葉內部細菌綱水平組成（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 4 Bacterial classes from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

圖5 不同病害侵染狀態下赤松針葉內部細菌屬水平組成（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 5 Bacterial genera from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

在針闊混交林中，對679 個OTU 進行門、綱和屬水平上的歸類，分屬28 個門、69 個綱、205 個屬。在門水平上（圖3a），變形菌門（Proteobacteria）占比最高，分別在4 類樣品中占比55.39%、62.89%、38.53%、71.42%，變形菌門為針葉內生細菌中的優勢菌群，且在樣本中的相對豐度存在差異。ZK1 中相對豐度較高的門還有放線菌門（Actinobacteria）（11.42%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（8.09%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（5.78%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（4.61%）。ZK2 中相對豐度較高的門同ZK1 一致，占比略有差異，放線菌門（9.85%）、酸桿菌門（7.84%）、擬桿菌門（4.07%）、芽單胞菌門（3.68%）。ZK3 中相對豐度較高的門還有厚壁菌門（Firmicutes）（32.60%）、酸桿菌門（6.72%）、放線菌門（10.98%）。ZK4 中相對豐度較高的門還有酸桿菌門（14.61%）、浮霉狀菌門（Planctomycetes）（4.41%）、放線菌門（2.89%）。

在針葉混交林中，對656 個OTU 進行門、綱和屬水平上的歸類，分屬29 個門、65 個綱、190個屬。在門水平上（圖3b），變形菌門相對豐度最高，分別為54.45%、56.24%、63.48%、74.83%。CZ1 中的相對豐度較高的門還有酸桿菌門（9.03%）、擬桿菌門（8.63%）、厚壁菌門（7.43%）、放線菌門（6.11%）。CZ2 中種類構成與CZ1 相近，其中厚壁菌門（15.69%）相對豐度上升，酸桿菌門（6.51%）與擬桿菌門（4.58%）相對豐度降低，放線菌門（6.31%）相對穩定。CZ3 中的相對豐度較高的門還有厚壁菌門（11.09%）、酸桿菌門（12.08%）、放線菌門（1.46%）。CZ4 中相對豐度較高的門還有酸桿菌門（11.09%）、浮霉狀菌門（4.18%）、放線菌門（2.86%）。

兩種混交林中，無病斑針葉的內生細菌門水平結構一致，變形菌門均為優勢門，且其他相對豐度較高的菌門近似，包括放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門。隨著枯梢病的發生，在病斑較短的針葉中，均發生顯著的變化，兩種林分在該狀態下的內生細菌差異最大，主要差異由于針闊混交林中厚壁菌門相對豐度的升高。在病斑較長的針葉內生細菌優勢菌門一致，均由變形菌門、酸桿菌門、浮霉狀菌門和放線菌門構成，相對豐度無顯著差異。

2.3 細菌綱水平的優勢類群組成分析

在針闊混交林中，內生細菌綱水平構成見圖4a，無病斑及染病針葉內生細菌均以α-變形菌（Alphaproteobacteria）為優勢菌種，分別為34.26%、42.30%、28.53% 和63.68%。在ZK1 中，β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的占比分別為10.05%和7.06%，ZK2 中β-變形菌綱和γ-變形菌綱的占比分別為12.06% 和5.20%。ZK3 中特有芽孢桿菌綱Bacilli，占比為28.18%。ZK4 中，α-變形菌占比增高，且酸桿菌綱（Acidobacteria）（14.07%）和浮霉菌綱（Planctomycetacia）（4.41%）占比高于其他樣品（均低于1%）。

針葉混交林中，在內生細菌綱水平上（圖4b），4 類樣品中α-變形菌相對豐度均為最高，相對豐度分別為31.21%、39.51%%、52.66%和58.10%，呈現逐漸增高的趨勢。β-變形菌綱相對豐度分別為12.55%、10.36%、6.11% 和4.98%，γ-變形菌綱相對豐度分別為5.64%、3.39%、2.92%和1.73%，兩個綱的相對豐度均逐漸下降。芽孢桿菌綱（Bacilli）在CZ1、CZ2 和CZ3 中占比較高，3.32%、14.81%、7.10%，而CZ4 中低于1%。CZ4 中的δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria ）（10.03% ）、 酸 桿 菌 綱（10.56%）和浮霉菌綱（4.12%）占比較高。

兩種林分中，無病斑針葉內生細菌的優勢綱為α-變形菌綱。在染病初期，內生細菌的豐度差異主要來自于芽孢桿菌綱的豐度變化。在針闊混交林中，芽孢桿菌綱在病斑較短的針葉中占比顯著高于其他樣本。在病斑較長的針葉中，α-變形菌綱、酸桿菌綱和浮霉菌綱在兩種林分中組成優勢菌群。

2.4 細菌屬水平的優勢類群組成分析

在針闊混交林中，屬水平上（圖5a），unidenified 的屬占了較高的比例（42.40%、43.43%、32.89%、49.26%），在ZK1中，Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas的相對豐度均較高，4 個屬的占比分別達到了4.51%、3.20%、3.20%、1.68%。ZK2 中，Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas同樣占據了較高的比例（4.46%、5.73%、5.04%、2.28%），與ZK1 的優勢菌屬一致。ZK3 中，乳桿菌屬（Lactobacillus）、Kroppenstedtia、Bryocella、魏斯氏菌（Weissella）相對豐度較高（16.5%、8.09%、5.47%、2.36%），其中乳桿菌屬占比最高，Massilia、Endobacter和Sphingomonas相對豐度降低。在ZK4 中Bryocella、Endobacter、Singulisphaera和Sphingomonas相 對 豐 度 較 高（13.82%、13.13%、4.39%、2.76%）。

針葉混交林中（圖5b），unidenified 的屬同樣占了較高的比例（36.59%、36.92%、38.38%、51.66%）。CZ1 中Bryocella（5.11%）、Massilia（4.52%）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）（4.32%）、Clostridium_sensu_stricto_1（3.59%）、Endobacter（2.99%）、薄層菌屬（Hymenobacter）（2.86%）和Sphingomonas（2.39%）占比較高，CZ2 中乳桿菌屬（6.97%）、Endobacter（4.91%）、Bryocella（4.78%）和Kroppenstedtia（4.12%）占比較高，與CZ1 的優勢菌存在差異。CZ3 中，Bryocella（7.84% ）、Endobacter（7.44% ）、 乳 桿 菌 屬（4.52%）、Sphingomonas（2.72%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）（2.66% ） 和Granulicella（2.19%）占比較高，其中Granulicella明顯高于其他樣品。CZ4 中，相對豐度較高的菌有Bryocella（8.50%）、Endobacter（8.37%）、甲基桿菌屬（8.10%）、Singulisphaera（3.98%）、Sphingomonas（3.45%）和Methylocella（2.72%），其中甲基桿菌屬與Singulisphaera在其他樣品中相對豐度低于1.00%。

兩種林分中，無病斑針葉共有的優勢屬有Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas，其它優勢屬硝化螺旋菌屬、Clostridium_sensu_stricto_1相對豐度有差異，但并不顯著。枯梢病侵染后，在病斑較短的針葉內細菌的屬中，Lactobacillus相對豐度的差異最大。在病斑較長的針葉中，Bryocella、Endobacter、Singulisphaera、Sphingomonas在兩種林分中均為優勢屬。

2.5 細菌Beta 多樣性分析

基于細菌綱水平的主成分分析，分析針闊混交林ZK 赤松針葉細菌的差異性（圖6a），結果表明，主成分PC1 與主成分PC2 的貢獻率分別為63.6%和26.4%，發病較重的針葉內生細菌與其余3 類相聚較遠，表明在枯梢病侵染較嚴重的情況下，內生細菌多樣性的變化較大，而無病斑針葉以及染病程度較輕的距離較近。染病較輕的狀態下與無病斑狀態相比，針葉內生細菌的構成差異較小。針葉混交林CZ 主成分分析（圖6b），主成分PC1與PC2 的貢獻率分別為71.17%和13.5%，其聚類規律與針闊混交林ZK 一致。

圖6 赤松針葉內部細菌主成分分析（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 6 Principal component analysis of endosphere bacteria in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

3 討論

通過高通量測序技術，對針闊混交林與針葉混交林的赤松針葉內細菌多樣性與群落結構進行分析，結果表明：針闊混交林的針葉中細菌有效序列388 587 條，共計679 個OTU，分屬28 個門、69 個綱、205 個屬；在針葉混交林針葉中的細菌有效序列336 600 條，共計656 個OTU，分屬29 個門、65 個綱、190 個屬。赤松針葉內生細菌多樣性豐富，無病斑針葉與染病針葉的優勢細菌為變形菌門，無病斑針葉中內生細菌菌屬為Massilia、Endobacter、Bryocella、Sphingomonas。在其他松屬類的內生細菌的研究中，經分離純化獲得的內生細菌優勢菌株與本研究結論一致[10]。

研究結果表明，隨著病害侵染的加重，內生細菌多樣性及豐度逐漸降低，與植原體對寄主根部內生細菌研究中得出的結論一致[11]，病原菌的入侵不僅對寄主植物組織造成危害，還對內生細菌的多樣性及群落結構產生影響。申紅妙[12]探明了桉樹內生細菌群落變化與桉樹對青枯病抗性間的關系，結果表明桉樹根部組織中內生細菌的豐度減低，但莖、葉中內生細菌的豐度未受影響，不同組織受病害的影響存在差異，該結論為不同部位的內生微生物與病害的相關研究中得出的不同結果提供理論支持。植物內生細菌長期生活在植物體內的特殊環境中并與宿主協同進化，內生細菌在植物體內的定殖是一個主動過程，可以通過自身的代謝產物或借助于信號傳導對植物體產生作用，而病原菌的入侵對內生細菌的定殖及傳播產生影響。

林分對土壤微生物的影響差異顯著[13-14]，在林分與內生細菌的研究中，兩種林分混交林的內生細菌多樣性及群落結構的變化趨勢相近，僅在部分優勢菌的種類存在差異，推測的原因是內生細菌多樣性更多地受到寄主的影響，不同于土壤微生物。無病斑針葉與染病針葉多樣性、群落結構等方面均存在差異，而兩種林分在枯梢病對針葉內生細菌的影響差異方面呈現一致的趨勢。綱水平上，兩種林分中的優勢綱均為α-變形菌，并隨病害的嚴重程度的加劇呈上升趨勢。屬水平上，無病斑針葉中的優勢菌群種類及相對豐度差別不大，Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas在兩種林分中均為優勢屬。在枯梢病菌侵染后的針葉內優勢細菌相對豐度受到影響，乳桿菌、Bryocella、Endobacter、 甲 基 桿 菌 屬Methylobacterium、Singulisphaera相 對 豐 度 升 高，Massilia和Sphingomonas占比下降。Massilia作為植物體內生菌，能夠以甘油或葡萄糖為前體高效合成聚羥基丁酸酯[15]。Endobacter常在紫花苜蓿中分離得到[16]，Bryocella作為好氧化異養型細菌[17-18]，本研究中侵染較重的針葉中，Bryocella相對豐度升高，也說明了該屬菌的生存未受病原菌的抑制。Sphingomonas在植物研究中發現具有一定的固氮作用，常在根際作為固氮細菌[19]，受病害影響呈相對豐度降低，其變化趨勢與其他病害對寄主的影響一致[20]。而染病針葉中Bryocella、Singulisphaera與乳桿菌屬相對豐度上升。Singulisphaera常見于土壤等腐殖質中，而本研究中，其在病害較重的針葉中出現，可推測在較重針葉內，細菌群落結構已被嚴重破壞，腐生性細菌入侵[21]。乳桿菌屬的部分種具有促生和提高發酵質量的功效[22]，也曾從植物組織內分離獲得[23]。此外，在針葉混交林中甲基桿菌屬上升。隨著病害的加重，甲基桿菌屬相對豐度升高，這與茶白星病侵染時豐度的表現一致[24]，但有研究表明甲基桿菌屬對部分病原微生物具有抑制性[25]，因此其對枯梢病病原菌是否具有抑制作用仍需進一步研究。

4 結論

在針闊混交林與針葉混交林中，赤松針葉內生細菌的多樣性及豐度隨枯梢病侵染的嚴重程度呈現下降的趨勢，兩種林分的內生細菌群落結構受枯梢病菌影響變化趨于一致。針闊混交林和針葉混交林中，無病斑針葉的相對豐度較高的內生細菌菌屬均為Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas。枯梢病菌的侵染影響了內生細菌的群落結構和多樣性，細菌多樣性及相對豐度隨枯梢病的加重而降低。