美洲黑楊表型核心種質庫構建

陳 存，丁昌俊，黃秦軍，李政宏，張 靜，劉 寧，李 波，蘇曉華

(林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091)

豐富的種質資源為植物育種、遺傳研究和新品種選育提供了條件和物質基礎[1-2]。為更好地應對當前氣候條件變化，急需培育出適宜在不同條件下生長的新品種，同時合理保護和利用植物種質資源是一項復雜的任務。在原始種質資源中挑選少部分有代表性的種質構建核心種質庫可以最大限度地保存其表型或遺傳多樣性，從而有效地解決種質資源保存中成本高等問題，縮短育種進程，促進種質資源的合理開發和利用[3-4]。

與作物種質資源核心種質庫構建相關的研究已有眾多報道[5-8]，其構建方法、策略和評價標準均相對成熟。參考作物核心種質庫的構建策略，多種木本植物核心種質庫已構建成功，包括葡萄（Vitis viniferaL.）[9]、油橄欖（Olea europaeaL.）[10]和角豆（Ceratonia siliquaL.）[11]等經濟樹種，歐洲黑楊（Populus nigraL.）[12]、木荷（Schima superbaGardn. et Champ.）[13]、杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）[14]和馬 尾松（Pinus massonianaL.）[15]等用材林樹種。當前，構建核心種質庫所選用的數據因研究目的不同，主要有表型數據或基因型數據[16]。植株的表型數據測量方便，在核心種質庫的構建研究中應用廣泛，同時隨著分子標記技術和基因組測序技術在核心種質庫構建研究中的應用，相關學者越發認識到植物表型研究的重要性和必要性。育種研究最終目的是獲得具有特定性狀和表型的新品種[7,17]，因此，基于表型數據構建核心種質庫仍是未來種質資源研究的重要內容。由于不同物種具有不同的表型特征和群體結構，在構建核心種質庫的研究中采用的取樣策略不同，均具有一定的優缺點，如隨機取樣策略可以更好的保存原始種質的群體結構，但構建的核心種質庫的代表性和多樣性相對較差；偏離度取樣可以保留較大的變異和多樣性；位點優先取樣策略不僅可以保留具有性狀極值的種質，同時可以較好的保留群體結構[18-19]。因此，研究者應根據所研究種質資源的特點選擇合適的取樣策略。

美洲黑楊（Populus deltoidesMarsh.）種質資源在楊樹育種研究工作中占有重要地位[20-21]，合理保護其表型和遺傳多樣性是高效開發和利用美洲黑楊種質資源的前提，本課題組通過前期對其表型和遺傳多樣性研究，發現原始種質資源庫具有豐富的多樣性[22]。為了更好地保存美洲黑楊種質資源，有研究者利用分子標記技術構建其核心種質庫[23-24]，但基于表型數據構建美洲黑楊核心種質庫的研究仍未見報道。本研究基于美洲黑楊種質資源表型和生理性狀，分析其群體結構，對種質資源進行分組，利用分組逐步聚類取樣的方法構建表型核心種質庫；通過與3 種常規取樣策略進行比較，首次提出性狀頻率取樣策略并用于構建美洲黑楊表型核心種質庫；在表型核心種質庫的基礎上通過補充部分種質構建表型優化核心種質庫，使其表型保留比例達到100.00%，最大化保存種質資源的表型多樣性信息。本研究有助于研究者更好的了解、保護和利用美洲黑楊種質資源，挖掘資源中的核心種質，為楊樹育種研究及其他物種表型核心種質庫構建奠定基礎和提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中的試驗材料包括美洲黑楊6 個種源群體、27 個采樣點的258 個無性系（表1）。種質來源地包括哥倫比亞河流域（美國華盛頓州，Was）、北美洲圣勞倫斯河流域（加拿大魁北克省，Que）和密西西比河流域（美國密蘇里州，Mis；艾奧瓦州，Iow；田納西州，Ten；路易斯安那州，Lou）。試驗材料與前期研究中的材料來源信息一致[22]。

1.2 植株培養及表型生理指標的測定

將美洲黑楊植株1 年生枝條剪成插穗，扦插于營養缽中（口徑18 cm，高度25 cm），每個無性系扦插10 株，在中國林業科學研究院通州試驗基地（39°73′35″ N，116°75′18″ E）溫室大棚進行培養，培養基質為黃土:粗砂石:草炭土 = 6:1:1。

在植株生長季，同時利用3 臺Li-6400 便攜式光合測定儀（Li-6400，LI-COR，美國）測定植株葉片的凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）和蒸騰速率（Tr），測定葉片為上部第5～7 片成熟葉片，每個無性系測定3 株。測量過程中充分考慮儀器、測量時間和環境等因素對測量指標的影響，將258 個無性系分為9 組，每組28～29 個無性系，測量時間分為3 個時間段（9：00—9：40、9：40—10：20 和10：20—11：00），每臺儀器在1 個時間段內可以完成1 組無性系1 株植株的1 個葉片光合參數的測量，最終使每個無性系測定的3 株的9 片葉片中每臺儀器在每個時間段各測定1 片，1 個生物學重復的測量周期為3 d，共測量9 d。使用葉綠素相對含量測定儀（SPAD-502，日本）測定植株上部第5～7 片成熟葉片的SPAD值，每個葉片選取6 個測定點，每個無性系測定3 株。

每個無性系選取3 株生長性狀相似的植株，各采集3～5 片成熟功能葉，稱鮮質量，使用葉面積儀（Yaxin-1241，北京）測量葉片形態性狀（長度、寬度和葉面積），然后使其風干稱風干質量，最后烘干并稱烘干質量。利用元素分析儀（Thermo Fisher Scientific，Inc.，美國），測定烘干葉片中的碳、氮元素的含量。

在植株生長后期，測量植株的株高、地徑和葉片數（葉痕數），同時對根系和莖段的生長量（干質量和鮮質量）進行測定。

表1 美洲黑楊種質資源來源信息Table 1 Source information of P. deltoides germplasm resources

1.3 數據處理

利用葉片的鮮質量、風干質量和烘干質量計算葉片自由水和結合水的含量，即自由水含量 = 鮮質量-風干質量；結合水含量 = 風干質量-烘干質量。

表型多樣性指數（Shannon-Wiener 指數，H'）的計算公式為：

式中：H'為Shannon-Wiener 指數；ln 表示自然對數；n為性狀指標總數；Pi表示某性狀指標第i種級別的無性系數占總無性系數的比率，各性狀指標被劃分為10 個級別，數值小于為第1 級別，數值大于等于為第10 級別，其中，每0.5σ劃分為一個級別。

無性系性狀頻率的計算公式為：

式中：Fj為第j個無性系的性狀頻率；n為性狀指標總數；Pij表示種質庫中第j個無性系的第i個性狀指標所在的性狀級別的頻率。

1.4 表型核心種質庫構建策略

利用表型和生理指標數據對6 個種源、258 個美洲黑楊無性系進行分組，Was 種源的無性系單獨為一組；Que 和Iow 種源無性系為一組；Mis、Lou和Ten 種源無性系為一組。基于無性系標準化的表型和生理指標數據計算每組內無性系間的歐式距離，采用可變類平均法對無性系進行聚類分析，在最低聚類水平上分別采用隨機取樣、偏離度取樣和位點優先取樣的策略構建表型核心種質庫。同時，本研究首次提出性狀頻率取樣策略，即在聚類的最低級別的兩個或多個無性系中優先選擇具有性狀極值的無性系，如果均具有性狀極值均進入下一輪聚類分析，如果均沒有性狀極值則選擇性狀頻率低的無性系進入下一輪聚類分析，以此類推，直到構建的種質庫不滿足核心種質庫構建標準。

1.5 表型核心種質庫代表性檢驗方法

參照前期研究中表型核心種質庫的檢測方法，通過計算構建的種質庫相對于原始種質庫的極差符合率（CR）、變異系數變化率（VR）、均值差異百分率（MD）、方差差異百分率（VD）和表型保留比例（RPR）對種質庫的代表性進行評價，各參數的計算公式[5,18]如下：

式中：RC(i)是核心種質第i個性狀的極差，RI(i)是原始種質第i個性狀的極差，n是性狀總數。

式中：CVC(i)是核心種質第i個性狀的變異系數，CVI(i)是原始種質第i個性狀的變異系數，n是性狀總數。

式中：St是核心種質與原始種質進行t測驗得到的均值差異顯著（α= 0.05）的性狀數，n是性狀總數。

式中：SF是核心種質與原始種質進行F測驗得到的方差差異顯著（α= 0.05）的性狀數，n是性狀總數。

式中：MC(i)是核心種質第i個性狀的表現型個數，MI(i)是原始種質第i個性狀的表現型個數，n是性狀總數。

通過計算各個種質庫各個性狀指標的表型多樣性指數（H'）對種質庫的多樣性進行評價。基于主成分分析構建的前2 個主成分因子的得分，繪制原始種質庫和表型核心種質庫的分布圖，對表型核心種質庫進行確認。

表型核心種質庫構建的最低標準為：MD＜20.00%且CR＞ 80.00%，RPR經常作為評價表型核心種質庫有效性和取樣比例必不可少的參數，本研究要求核心種質庫的RPR＞ 90.00%，同時認為MD越小，CR、VR和VD越大表型核心種質庫越能代表原始種質庫的多樣性[18]。

1.6 優化核心種質庫構建策略

在原始種質庫中挑選出表型核心種質庫后剩余的種質稱為保留種質。基于表型保留比例最大化的思想（RPR= 100.00%），分析并統計表型核心種質庫相對于原始種質庫中各性狀指標丟失的表型類型，然后在保留種質中挑選最少數量的具備相應表型的無性系補充到表型核心種質庫中形成表型優化核心種質庫，當多個無性系均具有相應表型類型時，選擇性狀頻率低的無性系，該部分無性系稱為表型補充種質，最后對表型優化核心種質庫進行評價。

2 結果與分析

2.1 不同類群表型和生理特征分析

對美洲黑楊3 個類群的表型和生理指標進行對比分析（表2），發現第1 類群（Was 種源）無性系的株高（H）、葉片數（LN）、葉片碳元素含量（C）、葉片氮元素含量（N）、Pn和Tr高于另外2個類群的無性系；第2 類群（Iow 和Que 種源）無性系的根系鮮質量（RFW）、根系干質量（RDW）和葉綠素相對含量（SPAD）最大；第3 類群（Mis、Lou 和Ten 種源）無性系的地徑（GD）、莖段和葉片的生長量、葉片形態性狀、葉片自由水和結合水含量、Gs和Ci均高于另外2 個類群。3 個類群的表型和生理特征均比較明顯，在該分組的基礎上分別在組內篩選代表性的無性系構建核心種質庫可以更好的代表美洲黑楊群體的表型和生理特征。

表2 不同類群表型和生理指標特征分析Table 2 Phenotypic and physiological characteristics of different groups

2.2 不同取樣策略核心種質庫構建

在構建美洲黑楊表型核心種質庫時，基于不同的取樣策略得到的結果存在較大差異（表3）。采用隨機取樣策略時，構建的第6 個種質庫（R6）的RPR為87.57%，低于90.00%，初步認定第5 個種質庫（R5）為核心種質庫，包括32 個無性系，取樣比例為12.40%，MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、9.52%、85.69%、116.31%和91.90%；采用偏離度取樣策略時，共構建了5 個種質庫，第4 個種質庫（D4）被初步認定為核心種質庫，取樣比例為19.38%，MD、VD、CR、VR和RPR分別為9.52%、28.57%、93.17%、113.44%和94.71%；采用位點優先取樣策略時，共構建了8 個種質庫，第8 個種質庫（P8）的RPR低于90.00%，初步確定第7 個種質庫（P7）為核心種質庫，包括32 個無性系，MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、76.19%、100.00%、141.66% 和91.69%；采用性狀頻率取樣策略時，共構建了10 個種質庫，第10個種質庫（F10）的RPR為89.89%，第9 個種質庫（F9）被初步認定為核心種質庫，取樣比例為10.47%，MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、80.95%、100.00%、148.94%和90.85%。在隨機取樣、偏離度取樣和位點優先取樣策略下形成的種質庫之間H'沒有顯著的變化，而在性狀頻率取樣策略下，H'在不同種質庫間存在明顯差異，隨著取樣比例的減少，H'先增大后減小，但在4 種不同的取樣策略下構建的核心種質庫的H'與原始種質庫均沒有顯著差異，均能代表原始種質庫表型和生理性狀的多樣性。

表3 不同取樣策略種質庫對比分析Table 3 Comparative analysis of banks with different sampling strategies

通過對比不同取樣策略下構建的核心種質庫的評價參數可以看出：通過性狀頻率取樣策略構建的核心種質庫在取樣比例最低的前提下，MD為0.00%，VD、CR和VR均高于另外3 種取樣策略，代表性最好，而且在構建核心種質庫的過程中，性狀頻率可以更好的對無性系進行區分，表明性狀頻率取樣策略在構建美洲黑楊表型核心種質庫的研究中是可行的，而且優于隨機取樣、偏離度取樣和位點優先取樣的策略。

2.3 表型核心種質庫和表型優化核心種質庫的構建

通過對比不同取樣策略構建的核心種質庫的有效性，最終采用性狀頻率取樣策略構建美洲黑楊表型核心種質庫。核心種質庫共包括27 個無性系，在第1、第2、第3 類群中分別選取了2、15、10個無性系，在每個種源中均有無性系被選擇(表4)，說明取樣策略具有一定的代表性和廣泛性。

表4 原始種質庫、表型核心種質庫與表型優化核心種質庫的組成Table 4 The composition of original, phenotypic core and phenotypic optimize core banks

表型核心種質庫的RPR為90.85%（表3)，通過與原始種質庫進行對比發現：其在14 個表型和生理性狀上共缺失了19 個表現型，為了使RPR達到100.00%，在保留種質中挑選最少數的無性系，使其表型和生理性狀包括缺失的19 個表現型，最終篩選出5 個美洲黑楊無性系為補充種質，補充到表型核心種質中，形成表型優化核心種質庫。表型優化核心種質庫的取樣比例為12.40%，共32 個美洲黑楊個體，其中，Was、Que、Iow、Lou、Ten和Mis 種源各選擇了2、16、1、5、7、1 個無性系(表4)。表型優化核心種質庫的MD、VD和VR分別為0.00%、71.43%和142.19%，CR和RPR均達到了100.00%，平均表型多樣性指數為2.097(表3)，表明表型優化核心種質庫保留了原始種質庫21 個表型和生理性狀的極值和10 個等級的表現型，極大限度地去除了冗余，可以有效地保存美洲黑楊群體的表型多樣性。

2.4 表型核心種質庫和表型優化核心種質庫的確認

為了進一步對核心種質庫進行確認，基于21 個表型和生理性狀進行主成分分析提取的第1、第2 和第3 主成分因子得分繪制保留種質、核心種質和補充種質的分布圖，從圖1 可看出：保留種質的分布存在大量的重疊現象，表明種質間表型相似性高，而表型核心種質均勻分布在原始種質范圍內，沒有重疊現象，說明核心種質庫去除了冗余，具有良好的代表性。補充種質進一步的豐富了核心種質的分布范圍，形成的表型優化核心種質庫具有更好的代表性。

圖1 保留種質、核心種質和補充種質的 PCoA 分析Fig. 1 PCoA analysis of original, core and supplementary collection

3 討論

3.1 表型核心種質庫構建的分組策略

在表型核心種質庫構建的過程中，對原始種質進行合理的分組，可以提高組內的冗余度，通過聚類取樣可以快速鑒定相似種質，提高核心種質庫的表型或遺傳變異[25-26]。前期研究表明：由于基因組DNA 突變、遷移、選擇和漂變的綜合作用，使不同種源具有不同的表型和遺傳特征[27]，因此，可以基于種源地理信息對原始種質進行分組[28-29]；但Katinas 等[30]認為，僅以種源地理信息為依據對種質進行分組可能達不到預期效果，同時結合種質的表型或遺傳信息特征的聚類分析結果對其進行分組，構建的核心種質庫更具有代表性[8]。本研究中，基于表型和生理性狀分析美洲黑楊種質資源的群體結構并對其進行分組，發現不同類群的個體間表型和生理特征差異顯著，但每個類群內個體間的相似性較高，因此，通過分組取樣可以快速降低資源的冗余度，有效提高種質庫的表型變異和多樣性水平。

3.2 表型核心種質庫構建的取樣策略

根據不同的種質資源特點制定合適的取樣策略是核心種質庫構建研究中首先需要解決的重要問題。目前，常規取樣策略包括隨機取樣、偏離度取樣和位點優先取樣。張歡等基于水青樹（Tetarcention sinenseOliv.）葉片表型性狀比較3 種不同取樣策略，發現利用位點優先取樣策略構建的核心種質庫保留了原始種質庫的多樣性，且種質庫的差異水平明顯提高[31]；在構建櫻桃番茄（Lycopersicon esculentumMill.）核心種質庫的研究中發現，3 種不同取樣策略均能提高種質庫的變異水平，其中，利用偏離度取樣策略構建的核心種質庫具有更好的代表性[32]；李洪果在構建杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）雄性資源核心種質庫的研究中發現，采用位點優先取樣策略構建的核心種質最大程度代表了原始種質庫的表型變異特征[33]。本研究中提出的性狀頻率取樣策略，即優先選擇具有極值的個體，然后基于性狀頻率對其他種質進行篩選。通過與上述3 種取樣策略比較發現，性狀頻率取樣策略可以更好的對種質進行鑒定和區分，從而有效降低種質庫冗余，增加核心種質庫變異水平，因此，性狀頻率取樣策略在美洲黑楊核心種質庫構建的研究中更加可行有效。

3.3 表型核心種質庫構建的評價標準

在核心種質庫構建研究中如何有效對其評價至關重要。目前，主要通過與原始種質庫的性狀均值（MD）、方差（VD）、極差（CR）和變異系數（VR）之間的差異比較，評價基于表型性狀構建核心種質庫的代表性，認為在MD＜ 20.00%且CR＞80.00%時構建的核心種質庫有效，且MD越小，VD、CR和VD越大，核心種質庫的代表性和多樣性越好[1,12,16,18,31]；同時RPR可以直接反映核心種質庫保留表型性狀信息的多少，是評價其有效性必不可少的參數[5,28]。本研究中，采用MD、VD、CR、VR和RPR對美洲黑楊核心種質庫進行評價，在常用標準的基礎上確保核心種質庫的RPR＞ 90.00%，使其能夠保留更多的表型性狀信息，提高核心種質庫的代表性和有效性。最終構建的美洲黑楊表型優化核心種質庫的MD、VD、CR、VR和RPR分別為0.00%、71.43%、100.00%、142.19%和100.00%，并通過對比種質性狀的主成分分布圖對表型核心種質庫和表型優化核心種質庫的代表性進行了確認。

取樣比例是體現核心種質庫代表性的重要參數，由于不同種質資源具有豐富的多樣性，核心種質庫的取樣比例存在差異。草本植物核心種質庫的取樣比例主要在5.00%～40.00%之間[6,8,34]，木本植物的取樣比例則在10.00%～45.00%之間[10,15-14]。在本研究初期沒有規定核心種質庫的取樣比例，而是按照核心種質庫的評價標準，構建最小取樣比例的核心種質庫，最終構建的美洲黑楊表型核心種質庫的取樣比例為10.47%，表型優化核心種質庫的取樣比例為12.40%。

3.4 表型核心種質庫構建的性狀選取及展望

利用表型數據構建核心種質庫是最基本、最直接且最常用的方法[29]，但表型性狀容易受到外界環境的干擾，從而影響表型核心種質庫的有效性[28,32,35]，因此，在獲取種質資源表型性狀數據時應保證試驗材料的一致性，并嚴格控制植株生長的環境條件，減少材料本身及環境引起的誤差[36]；同時觀測性狀代表性、穩定性和可比性對表型核心種質庫的構建具有重要影響，葉片相關的形態指標在水青樹[31]、普通杏（Prunus armeniacaL.）[35]和灰楸（Catalpa fargesiiBur.）[37]等表型核心種質庫的研究中得到應用，植株生長、材性和生理性狀數據也經常作為構建表型核心種質庫的依據[12,27,37]。本研究中，主要利用植株生長、葉片形態、葉片養分含量、葉片葉綠素相對含量、光合參數等表型和生理性狀構建表型核心種質庫。由于光合參數與植株生長密切相關且易受外界環境的影響，為了保證光合數據的可比性，本研究同時使用3 臺光合儀進行測定，并將測量時間段進行劃分，制定合理的測量策略，從而減少測量時間、儀器和外界環境等因素的影響。

構建美洲黑楊核心種質庫參考的表型指標數據可以較全面的反映植株的生長特性，但表型性狀是植株基因與環境共同作用的結果，基于表型數據構建核心種質庫具有一定的局限性，因此，有必要結合本研究的分析結果進一步利用分子標記的方法分析美洲黑楊群體的遺傳結構并構建核心種質庫，使得構建的核心種質庫同時包括美洲黑楊的表型信息和遺傳信息，從而更加有效的保存美洲黑楊種質資源。

4 結論

美洲黑楊不同類群之間具有明顯的表型和生理特征，Was 種源個體的高生長量、葉片數和葉片養分含量和光合生理活性較高；Iow 和Que 種源無性系的根系生長較發達；Mis、Lou 和Ten 種源無性系的莖生長量、葉片生長量和葉片形態高于其他類群無性系。基于表型和生理性狀，通過與隨機取樣、偏離度取樣和位點優先取樣3 種常規取樣策略進行比較，首次提出并確定性狀頻率取樣策略為構建美洲黑楊表型核心種質庫的最適取樣策略。在258 個美洲黑楊種質中篩選出27 個核心種質，取樣比例為10.47%。篩選了5 個種質補充到表型核心種質庫中形成表型優化核心種質庫，使其表型保留比例達到100.00%。通過對表型核心種質庫和表型優化核心種質庫進行評價和驗證，表明均具有良好的代表性。美洲黑楊表型核心種質庫和表型優化核心種質庫的建立可以更好的對美洲黑楊種質資源進行管理、保護和利用，為有效保存、管理和利用美洲黑楊種質資源提供科學依據。