強化血糖、血壓控制對糖尿病足患者外泌體效應microRNA的影響

王琳　曾娜　謝瑋平　蔣月蓮　李政　唐麗珠　隆采丹　吳標良

【摘要】?目的?觀察糖尿病患者治療前后血外泌體分泌及效應因子miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平變化，探討強化血糖、血壓控制對糖尿病足潰瘍創面愈合的作用機制。方法?30例糖尿病足患者分別于強化治療1周前后采血，抽提外泌體，行外泌體鑒定，觀察外泌體分泌情況并測定miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平。結果?強化血糖、血壓治療后，糖尿病足患者血外泌體miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平升高（P<0.05）;相關性分析顯示miR-126-3P水平與空腹血糖（FBG）呈正相關關系（r=0.37，P<0.05）。結論?強化血糖、血壓控制可升高糖尿病足患者外泌體miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平，可能對糖尿病足潰瘍創面愈合具有積極意義。

【關鍵詞】?血糖;血壓;糖尿病足;外泌體;microRNA

中圖分類號：R587.2???文獻標志碼：A???DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.02.004

【Abstract】?Objective?To observe serum exosomes secretion and the changes of levels of mir-126-3p and mir-125b-1-3p in diabetic patients before and after treatment， and to explore the mechanism of intensive blood glucose and blood pressure control on the wound healing of the diabetic foot ulcers. Methods?Blood collection， exosomes extraction and identification were respectively performed on 30 patients with diabetic foot before and after intensive treatment for 1 week. Exosomes were extracted and identified. And then， the secretion of exosomes was observed and the levels of miR-126-3p and miR-125b-1-3p were measured. Results?After intensive blood glucose and blood pressure treatment， blood exosomes miR-126-3P and miR-125b-1-3p levels in diabetic foot patients increased （P < 0.05）; and correlation analysis showed that miR-126-3P levels were positively correlated with fasting blood glucose （FBG） （r = 0.37， P < 0.05）. Conclusion? Intensive blood sugar and blood pressure control can increase the levels of exosomes miR-126-3P and miR-125b-1-3p in diabetic foot patients， which may have positive significance for the wound healing of diabetic foot ulcers.

【Key words】?blood sugar; blood pressure; diabetic foot; exosomes; microRNA

糖尿病的發病率逐年升高，包括糖尿病足（diabetic foot，DF）等在內的并發癥相應增加[1]。目前尚不清楚糖尿病足潰瘍創面的愈合機制。外泌體可被多種細胞類型釋放在血液和其他體液中，是一種易獲取、性質穩定且無創性的代謝性疾病生物標志物[2～3]。外泌體中包含的小分子核酸MicroRNAs （miRNAs）是一類廣泛的小型非編碼RNA，主要通過與信使RNA靶點的編碼區和非編碼區的互補序列相互作用來抑制基因表達和蛋白質翻譯過程，在目標組織中可調節炎性胰腺細胞、促進血管內皮細胞再生，并影響胰島素信號、代謝信號、細胞存活周期等[4]，從而影響疾病的發生與進展。目前已有研究表明外泌體miR-126-3P、miR-125b-1-3p在慢性潰瘍創面愈合中具有積極意義[5～6]，本實驗擬通過觀察強化血糖、血壓控制對miR-126-3P、miR-125b-1-3p的影響，探討強化血糖、血壓控制對糖尿病足潰瘍創面愈合的作用機制。

1?對象與方法

1.1研究對象?收集自2019年6月～2020年5月在右江民族醫學院附屬醫院住院的30例2型糖尿病足（T2DMF）患者作為研究對象。2型糖尿病（T2DM）的診斷及分型標準以1999年世界衛生組織（WHO）指南為準[7];糖尿病足參照“糖尿病足防治國際指南（2019）”診斷[1]。收集患者一般信息及臨床試驗指標，采集治療前后血液標本供檢測。

1.2?強化治療方案?強化血糖、血壓控制目標：空腹血糖（FBG）4.4～6.1 mmol/L，餐后2小時血糖（2 h PBG）4.4～8.0 mmol/L;血壓（SBP/DBP）≤130/80 mmHg[8]。

1.3?樣本采集及鑒定?采集治療前后血液標本，exoEasy試劑盒提取外泌體、Western Blotting法檢測外泌體特征蛋白CD9、CD63。用exoEasy試劑盒提取外泌體后將樣本凍存。Western Blotting實驗：將待測樣品剪碎、研磨，置于離心管中，加入RIPA裂解液（北京索來寶公司）進行充分裂解，提取總蛋白并使用ECL發光試劑盒（中杉金橋公司）測定總蛋白濃度。先用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離一定量的蛋白質，再注入等體積蛋白上樣，依次經過電泳、轉膜、封閉后置于4℃冰箱中保存一夜，在孵育一抗和二抗以后，用PBST洗滌3次，并曝光顯影;最后用Image J軟件分析圖像計算蛋白灰度值。

1.4?Real Time PCR技術檢測miR-126-3P、miR-125b-1-3p表達水平?外泌體鑒定完成后提取樣本總RNA，使用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒和miRcute miRNA（SYBR Green）試劑盒（均由天根生物科技有限公司提供）將RNA反向轉錄為互補的cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增實驗。此實驗以U6為內參，各樣品微小RNA表達量用U6表達量進行歸一化處理，最后用熒光定量PCR儀，用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。本實驗中的microRNA加尾法單向引物序列分別為miR-125b-1-3p：5′-ACGGGTTAGGCTCTTGGGA-3′，miR-126-3P：5′-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′，內參U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。

1.5?統計學方法?采用SPSS 26.0和 GraphPad Prism 7軟件進行統計分析和數據可視化處理。符合正態分布數據以均數±標準差（±s）表示，治療前后數據比較采用配對t檢驗。正態分布資料間的相關性采用Pearson相關分析。以α=0.05為檢驗水準，雙側檢驗。

2?結??果2.1?相關臨床指標比較?本次收集的糖尿病足患者年齡在35～70歲之間，男性17例，女性13例，糖尿病足病程為1個月～1年。強化治療前后的FPG、2 hPBG、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2?血清外泌體鑒定?抽提患者強化治療前后的血清外泌體，通過Western Blotting法均可檢測到外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101，表明抽提物質為外泌體。見圖1。

2.3?強化治療前后血清外泌體?治療后miR-126-3P、miR-125b-1-3p表達水平較治療前顯著升高，比較差異有統計學意義（P<0.001）。見表2、圖2、圖3。

2.4?強化血糖控制前后相關臨床指標與目的microRNAs表達水平的相關性分析?將治療前后的FPG、2 hPBG、SBP、DBP和miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平之間的相關性采用Pearson相關性分析，結果顯示治療后空腹血糖水平與miR-126-3P表達水平呈弱正相關關系（r=0.37，P<0.05）。見圖4、圖5。

3?討??論

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）主要有四大類，其分類按大小、亞細胞來源和含量，可分為膜顆粒、微泡、外泌體和凋亡小泡[9]。外泌體是直徑大小在30～100 nm之間的有脂質雙分子層膜包裹的細胞外結構，其功能具有調節細胞間通訊的作用[10]，因此近年來也被作為糖尿病診斷的一種新型生物標志物[11]。

外泌體攜帶的眾多物質中，microRNAs受到廣泛關注。有研究已證實一些microRNAs在嚙齒動物的糖尿病中可作為特殊的生物標志物，例如，miR-24、miR-126、miR-146與糖耐量異常有關;miR-122、miR-210、miR-133與疾病進展相關;miR-21-5p與炎癥發生相關[12～13]。在眾多動物實驗中發現miR-126-3P、miR-125b-1-3p有抑制炎癥和促進血管再生的作用[5，14～15]。本次實驗發現強化血糖治療后，糖尿病足患者的血清miR-126-3P、miR-125b-1-3p基因表達量與治療前有顯著差異，且表達量均升高，觀察到這兩種基因的高表達促進了糖尿病足潰瘍面的愈合，其可能的機制與表觀遺傳機制相關。有研究表明[16]，在糖尿病足這一并發癥中，高血糖、炎癥因子和氧化應激等因素，可以調節表觀遺傳機制，影響靶細胞中miR-126-3P、miR-125b-1-3p等基因的表達，從而影響糖尿病足的發展與預后。可能參與的信號通路有細胞外調節蛋白激酶（ERK）通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路，miR-126-3P參與下調磷脂酰肌醇-3激酶調節亞單位2（PIK3R2），并激活PI3K，介導Akt/PKB的磷酸化，促進外周血管再生，從而影響糖尿病足創面的愈合和控制疾病進展。本實驗還發現空腹血糖水平與miR-126-3P表達水平呈弱正相關關系，有關研究表明[17]，胰島素受體底物（IRS-1）表達也可被miR-126-3P抑制，從而減少胰島素的抵抗，有利于機體調控血糖代謝水平，這為將miR-126-3P基因作為新型生物標志物用于糖尿病代謝治療提供了科學依據。

本實驗發現在高血糖環境中miR-125b-1-3p的表達下調，糖尿病足患者其微血管內皮細胞的功能隨miR-125b-1-3p的升高而受到保護。且通過強化血糖、血壓的控制，miR-125b-1-3p表達上調后，炎癥反應被抑制，從而促進新生血管再生，有利于創面愈合，但其具體的作用機制有待于進一步研究。

綜上所述，強化血糖、血壓控制可上調miR-126-3P、miR-125b-1-3p基因的表達，這可能是強化代謝治療促進糖尿病足潰瘍創面愈合的原因之一。本實驗受樣本量少的限制、采血間隔周期短及個體差異大等因素的影響，對臨床資料與miR-126-3P、miR-125b-1-3p表達水平關系作出的結論有一定限制性。針對以上不足，還有待在進一步的研究中加以改進和證實。

參 考 文 獻

[1]International Working Group on the Diabetic Foot （IWGDF）. International Working Group on the Diabetic Foot Guideline on the diagnosis and treatment of foot infection in persons with diabetes： Part of the 2019 IWGDF Guidelines on the prevention and management of diabetic foot disease.徐 俊，許樟榮（譯）.國際糖尿病足工作組：糖尿病足感染診斷與治療指南 ——《國際糖尿病足工作組：糖尿病足防治國際指南（2019）》的一部分[J]. 感染、炎癥、修復，2019，20（4）：207-229.

[2] ?MULLER G. Microvesicles/exosomes as potential novel biomarkers of metabolic diseases[J]. Diabetes Metab Syndr Obes，2012，5：247-282.

[3] ?YING W， RIOPEL M， BANDYOPADHYAY G， et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity[J].Cell，2017，171（2）： 372-384.

[4] ?CHANG W G， WANG J X. Exosomes and Their Noncoding RNA Cargo Are Emerging as New Modulators for Diabetes Mellitus[J].Cells，2019，8（8）：853.

[5] ?ZAMPETAKI A， KIECHL S， DROZDOV I，et al.Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes[J].Circ Res，2010，107（6）： 810-817.

[6] ?OLIVIERI F，BONAFE M，SPAZZAFUMO L，et al.Age- and glycemia-related miR-126-3p levels in plasma and endothelial cells[J].Aging （Albany NY），2014，6（9）：771-787.

[7] ?秦娟， 吳艷， 朱曉榮， 等. 2型糖尿病并發惡性腫瘤風險的Logistic回歸分析[J].腫瘤預防與治療，2017，30（6）：433-436，452.

[8] ?王力，王群慧，何揚，等.強化血糖控制對糖尿病患者第一時相胰島素分泌的影響[J]. 中國醫藥導報， 2016，13（18）：76-79.

[9] ?STAHL P D，RAPOSO G.Extracellular Vesicles： Exosomes and Microvesicles， Integrators of Homeostasis[J].Physiology （Bethesda），2019，34（3）：169-177.

[10] ?COLOMBO M，RAPOSO G，THERY C.Biogenesis，Secretion，and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2014，30：255-289.

[11] ?CASTANO C， NOVIALS A， PARRIZAS M. Exosomes and diabetes[J].Diabetes Metab Res Rev， 2019，35（3）：e3107.

[12] ?DELIC D，EISELE C，SCHMID R，et al. Characterization of Micro-RNA Changes during the Progression of Type 2 Diabetes in Zucker Diabetic Fatty Rats[J].Int J Mol Sci， 2016，17（5）：665.

[13] ?SEYHAN A A， NUNEZ L Y， XIE H， et al.Pancreas-enriched miRNAs are altered in the circulation of subjects with diabetes： a pilot cross-sectional study[J].Sci Rep，2016，6：31479.

[14] ?SILAMBARASAN M， TAN J R， KAROLINA D S，et al.MicroRNAs in Hyperglycemia Induced Endothelial Cell Dysfunction[J]. Int J Mol Sci，2016，17（4）：518.

[15] ?OLIVIERI F， PROCOPIO A D， MONTGOMERY R R.Effect of aging on microRNAs and regulation of pathogen recognition receptors[J].Curr Opin Immunol，2014，29：29-37.

[16] ?OLIVIERI F， SPAZZAFUMO L， BONAFE M， et al. MiR-21-5p and miR-126a-3p levels in plasma and circulating angiogenic cells： relationship with type 2 diabetes complications[J]. Oncotarget，2015，6（34）：35372-35382.

[17] ?盧佩穎.2型糖尿病患者血清miR-126表達的分析[D].杭州：浙江大學，2015.

（收稿日期：2020-09-03?修回日期：2020-11-16）

（編輯：王琳葵?梁明佩）