天然膠原交聯劑在牙本質粘接領域中的研究進展

張 煒，王景云

（吉林大學口腔醫院，長春 130021）

在過去的幾十年中，樹脂-牙本質粘接技術一步步發展，在牙體缺損修復上取得了相對可靠的臨床效果，但與牙釉質粘接相比其粘接持久性仍存在著欠缺[1]。牙本質結構特殊，有機物含量約占其體積的30%，其中膠原蛋白占絕大多數，主要為Ⅰ型膠原。牙本質粘接修復的粘接力主要依賴于酸蝕后脫礦牙本質表層的膠原纖維網和粘接劑所組成的混合層（hybrid layer，HL）[2]，混合層的質量對樹脂修復體的粘接強度和使用壽命至關重要。由于樹脂單體在脫礦后的牙本質膠原纖維內的滲透漸進性的特點，導致酸蝕的深度與樹脂滲透的深度不一致從而在混合層底部產生裸露的膠原纖維區域，此區域內殘留的水分子會使溶解的樹脂析出，同時被激活的牙本質內源性膠原蛋白水解酶也會使裸露的膠原纖維逐漸發生降解[2][3]，混合層結構崩塌，從而影響牙本質粘接的耐久性。

在牙本質粘接的實驗室研究中，已經發現天然來源的交聯劑可以通過增加膠原纖維間和纖維內共價交聯的數量，改善牙本質粘接的耐久性，膠原蛋白交聯被認為是增強脫礦牙本質基質對內源性酶降解的抵抗性的有效方法，并可獲得具有改善機械強度的穩定混合層，有研究通過使用交聯劑預處理酸蝕后的牙本質人為地增加了膠原蛋白原纖維的穩定性[4][5][6]。天然膠原交聯劑按化學結構分為天然多酚類（原花青素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、單寧酸、姜黃素和貽貝蛋白等）、環烯醚萜類（如京尼平）和大分子多糖類（如海藻酸）。

1 天然多酚類

1.1 原花青素（PA）

原花青素主要來源于植物，其中葡萄籽提取物（GSE）為最主要的來源之一，屬于縮合單寧類，是高度羥基化結構，能夠與蛋白質形成不溶性復合物，在發育過程中增加膠原蛋白的合成并加速可溶性膠原蛋白向不溶性的轉化[7]，穩定并增加了I 型膠原原纖維的交聯[4]。有研究表明低濃度的PA可通過改變化學性能并提高脫礦質牙本質的機械性能，使用6.5%GSE分別處理脫礦牙本質基質10min和4h，測量其剛度增加了約8~40倍[6]，它與戊二醛和膠原蛋白的作用機制不同，PA 和膠原蛋白的相互作用主要通過蛋白質酰胺羰基和酚羥基之間的氫鍵導致外源性交聯，而其產生的疏水鍵又會減少水的吸附，相對于其他多酚類物質擁有相對較大的結構穩定性，此外，PA 還可通過隱藏或者修飾膠原蛋白分子內酶的切割位點來抑制基質金屬蛋白酶的活性[7]。

1.2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯，一種綠茶多酚，已被證明可抑制了基質金屬蛋白酶（MMP）-2 和基質金屬蛋白酶（MMP）-9 的明膠分解活性，體外研究表明，EGCG 可以通過降低牙本質中的MMPs 活性阻止牙本質被酶解[8][9]。EGCG是具有最強牙本質交聯能力的單體兒茶素，它對膠原蛋白的機械性能和抵抗蛋白水解降解的穩定作用都具有積極作用，即使在低至0.0065%的濃度下也顯示出對MMPs 的抑制作用[10]。EGCG 結構中含有酚羥基，通過親水性的羥基與膠原纖維形成氫鍵以及芳香環的疏水相互作用共同穩定膠原蛋白，另外它對金屬離子具有很高的親和力，金屬離子與EGCG 結合后會阻止MMP 的識別能力進而抑制膠原蛋白分解[11]。

1.3 槲皮素（quercetin ）

槲皮素是飲食中最常見的黃酮醇，可下調在前列腺癌細胞中MMP-2 和MMP-9 的表達[12]。槲皮素的分子結構與原花青素單體兒茶素或表兒茶素相似，因此槲皮素交聯也可能與基質蛋白的酚羥基和酰胺羰基或羥基之間的氫鍵形成有關[13]。粘接劑中的槲皮素可以與牙本質膠原交聯，這種能力使槲皮素在牙本質基質中保持相對穩定，其細胞毒性濃度又比機制明確的化學膠原交聯劑戊二醛低100 倍，同時Mirzoeva 已經證明槲皮素可以通過解耦能量傳導細胞質膜并抑制細菌運動，從而產生抗菌作用，將500μg/mL 槲皮素摻入粘接劑中，可以達到抗菌改性，粘接強度和細胞毒性三者的平衡狀態[14]。

1.4 單寧酸（Tannic acid）

單寧酸是一類特殊的可水解丹寧酸，以葡萄糖作為核心，葡萄糖的羥基被五個沒食子酸基酯化[15][16]。單寧酸通過交聯纖維狀膠原蛋白和抑制MMP來防止膠原蛋白基質降解，單寧酸與富含脯氨酸的蛋白（如彈性蛋白和膠原蛋白）中的疏水區特異性結合形成多個氫鍵證明了其在酶穩定性方面的作用[15][17]。最近，Jackson 等人研究了單寧酸在穩定膠原蛋白抵抗膠原酶作用中的作用，并發現含沒食子酰基的多酚（如單寧酸）可能通過與單寧酸結合而抑制膠原酶的活性[15]。另有研究表明，單寧酸通過氫鍵結合到膠原分子形成了穩定的單寧酸-牙本質基質復合物增加了脫礦質牙本質基質的彈性模量，顯著改善牙本質基質性能和樹脂-牙本質結合強度[18]。

1.5 貽貝黏附蛋白（Mussel adhesion protein，MAP）

海洋貽貝是至今研究最為廣泛的附著動物之一，貽貝粘附蛋白是海洋貽貝分泌的一種蛋白質，是海洋貽貝牢固附著在潮濕表面上的關鍵組成部分。貽貝粘附蛋白的粘合性能主要因為結構中含有3，4-二羥基-苯丙氨酸（DOPA）。DOPA 包含具有氫鍵和金屬配體能力的鄰苯二酚基[19][20]。科學家在粘接劑中添加了模仿貽貝黏附蛋白的物質形成了鄰苯二酚聚合物，有效改善了被人工唾液污染的牙本質表面的樹脂粘接強度[21]。隨著仿生技術的進步，未來的牙本質粘合劑單體可能包含源自水生動物（例如貽貝和藤壺）分泌的蛋白質，這使得它們對粘接物的表面能的依賴性降低，并且不易被水解降解[22]。

2 環烯醚萜類

京尼平（genipin，GE）從梔子果實中提取的天然交聯劑，屬于環烯醚萜類化合物，其細胞毒性很低，比戊二醛低約10000 倍，被稱為低毒交聯劑，可以有效提高其對酶消化的抵抗力減緩膠原蛋白的降解[23]，并改善其機械性能[24][25][26]。有實驗驗證了京尼平與膠原分子內或相鄰膠原分子之間的賴氨酸（Lys），羥賴氨酸（Hyl）或精氨酸的游離氨基反應，使賴氨酸（Lys）和羥基賴氨酸（Hyl）殘基以濃度依賴性方式顯著降低，形成分子內或分子間新的交聯鍵[27]，使用京尼平處理牙本質膠原40h 后其拉伸強度值增加了約80%[28]。目前，有關京尼平交聯的研究多集中于鞏膜及心包膜支架方面，在牙本質粘接強度方面多用于幾種交聯劑之間的比較研究，其對牙本質粘接耐久性方面的研究仍需深入。

3 大分子多糖類

海藻酸（alginic acid）是一種天然多糖，其結構中含的羥基和羧基通過酯化反應形成酯鍵與膠原蛋白的游離氨基反應實現膠原與海藻酸的共價交聯，并且尚未觀察到海藻酸交聯材料的細胞毒性[29][30]。海藻酸可被高碘酸鹽氧化并形成多個功能性醛基（藻酸鹽二醛，ADA）。因此，ADA 可以使用其多個功能性醛基與戊二醛以相同的方式與游離氨基發生反應，發現ADA 不僅可以有效地交聯生物組織，還可有效增強對生物組織酶促降解的抵抗力[31]。有研究表明經海藻酸處理后的膠原蛋白仍可以保持其三重螺旋結構，而保持膠原蛋白的結構完整性可以穩定膠原蛋白[32]。有研究使用2%ADA 處理脫礦牙本質使膠原纖維網保持蓬松同時抑制MMP-9活性，提高樹脂牙本質粘接即刻及老化后的微拉伸強度[33]。

4 結語

天然膠原交聯劑從植物中提取，來源廣泛，在抑制基質金屬蛋白酶的活性的同時可以對膠原纖維進行交聯，用于牙本質表面可提高牙本質基質的穩定性和抗酶解能力，改善牙本質粘接耐久性，近些年來日趨成為牙本質粘接領域中的研究熱點之一。不過天然膠原交聯劑從實驗室研究轉入臨床應用仍有較長的一段路要走，因其種類繁多，在不同的粘接體系中，交聯劑的添加方式，添加濃度和作用時間仍需進一步探索，個別實驗已經證明了部分天然來源的交聯劑的低毒性甚至無細胞毒性，使其在牙本質粘接領域方面具有廣闊的臨床應用前景。