母乳中四環素類抗生素及其代謝產物的檢測方法研究進展*

徐斯琦，李 強，苗 萌

(1 上海健康醫學院醫學技術學院，上海 201318；2 上海普陀區疾病預防控制中心理化檢驗科，上海 200333)

四環素類抗生素是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，包括金霉素、土霉素、四環素及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素、二甲胺四環素等，其結構均含并四苯基本骨架[1]。四環素類是主要抑制細菌蛋白質合成的廣譜抗生素，高濃度具有殺菌作用，臨床上用于多種細菌及立克次氏體、衣原體、支原體等所致之感染，此外，四環素也被廣泛應用在畜牧業中，以此來促進動物生長、改善飼料利用率、降低死亡率等[2]，是最常見和最重要的抗生素之一。

1 母乳中四環素類抗生素對人類的影響

據衛生部的數據顯示，我國已經成為世界上位列第一的抗生素使用大國，在醫療、畜牧、農產品等多個領域，抗生素的濫用現象都非常嚴重，我國已經意識到抗生素濫用所帶來的巨大危害，并且制定了《抗菌藥物臨床應用指導原則》，以規范抗菌藥物的臨床應用[3]。母乳是產后女性乳房產生的用作哺育嬰兒的汁液，富含各種嬰幼兒成長必需的營養成分，如蛋白質、乳糖、脂肪、維生素和多種免疫球蛋白等，是新生兒降生初期最主要的營養物質來源。母乳喂養時間,一般認為以6個月到2歲為佳。但是，許多藥物可以滲透到乳汁中通過喂奶進人嬰幼兒體內，影響生長發育，如氯霉素、四環素、磺胺類藥物等，因此，哺乳期婦女的各種藥物暴露應該得到關注。動物源性食品作為哺乳期婦女必須攝入的食品，若被孕產婦長期低水平攝入抗生素，其造成的細菌耐藥性、畜產品藥物殘留、過敏中毒反應以及“三致作用”等[4]，將直接威脅到人類特別是嬰幼兒的健康與安危。根據目前的研究可以得知，哺乳期婦女服用四環素后，其分布于乳汁的濃度高于血液五倍，常規劑量就可致胎兒牙齒和骨骼發育不良、牙釉質缺損、灰色牙、棕色牙或黃色牙及短肢畸形、先天性白內障等[5]。新生兒即使短期服用四環素也極易引起乳齒的色素沉著。母親如果在妊娠期服藥，由于四環素能通過胎盤，也同樣會對胎兒產生同樣的影響，特別當妊娠已達六個月之后更易出現。此外，四環素類藥物不穩定，生物體中易生成差向異構體，如差向四環素、差向土霉素、差向金霉素，一些四環素的差向代謝物活性減弱但毒性增強[6]。因此，研究四環素類藥物的差向代謝物也具備重要的健康學意義。

母乳中四環素類抗生素及其代謝產物的測定，一方面可以作為哺乳期婦女的內暴露評估，另一方面可以作為嬰幼兒食物的外暴露評估，具有雙重的生物學意義。目前常用的檢測方法主要有高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)和液相色譜串聯質譜法(High performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, HPLC-MS)，同時也有薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC)、毛細管電泳法(Capillary electrophoresis, CE)、酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELASA)等，具有各自的特點和應用范圍，本文將對不同方法前處理過程與分析方法進行比較和闡述。

2 常用的檢測方法

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜技術是一種快速而可靠的技術，對四環素類抗生素殘留分析具有很高的靈敏度[7]，具有“高速、高效、高靈敏度、高自動化、應用范圍廣”等特點。李桂琴等[8]對比了 HLB 固相萃取柱、氨基柱和 C18柱，認為氨基柱對乳的凈化效果最好，選取氨基柱為凈化柱，0.1%甲酸-甲醇為洗脫劑，采用Waters Atalantis T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)，以水-乙腈(1:4，V/V)為流動相，建立了超高效液相色譜法對牛奶及奶制品中四環素類藥物殘留的分析，結果線性關系良好，回收率高。陳小燕等[9]選取HLB固相萃取柱為凈化柱，0.1%甲酸-甲醇為洗脫劑，采用Venusil? XBP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，0.01 mol/L草酸溶液+乙腈-甲醇(92:8,V/V)為流動相，建立了高效液相色譜法測定牛乳中四環素類抗生素的方法，對土霉素、四環素、金霉素和強力霉素四種四環素類抗生素的檢出限在0.46～0.52 μg/L，遠遠低于國內外規定的最大殘留限。

2.2 液相色譜串聯質譜法

液相色譜串聯質譜法依靠液相色譜系統進行分離，質譜系統進行檢測，是液相色譜和質譜聯用的一種技術。具有分離能力強、定性分析結果可靠、特異性強、自動化程度、靈敏度高等優勢，被認為是目前“效果較好”的分析手段[10]。高志瑩等[11]通過LC-MS/MS法，選取PLS固相萃取柱為凈化柱, 10%甲醇-乙酸乙酯為洗脫劑, 采用Thermo Hypersil Gold色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)分離,以0.1%甲酸水溶液-乙腈(梯度洗脫)為流動相，成功測定牛奶中氯霉素和四環素類抗生素含量，得到四環素類抗生素檢出限為0.5～10 μg/kg，該方法回收率高，相對標準偏差較小。段國霞等[12]選取HLB固相萃取柱為凈化柱，甲醇-乙酸乙酯(1:9，V/V)為洗脫劑,選用Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以0.1%甲酸水溶液+甲醇-乙腈溶液(1:1，V/V)為流動相，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定乳中四環素類藥物的殘留，得到液態乳中四環素類抗生素的定量限為2 μg/kg，該方法線性范圍寬，重復性好，適用于液態乳中四環素類抗生素的殘留測定。

2.3 薄層色譜法

薄層色譜法是利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在流動相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中，使組分互相分離[13]。其具有操作較簡單、檢測時間短、可定性定量等特點，是快速分離和定性分析少量物質的重要技術[1]。于新海等[14]在鑒定四環素類抗生素時采用薄層色譜法，以正丁醇-冰醋酸-水作為展開劑，5:2:3的配比體系在硅膠G薄層板上將土霉素進行展開時分離效果最佳。顧云等[15]對《中國藥典》中用薄層色譜法鑒定四環素類抗生素的方法作了改進，將硅藻土手鋪板改為默克硅膠60板F254，改用以水-甲醇-二氯甲烷(6:35:59)為展開劑，在365 nm的紫外光燈下檢測，能產生較強的熒光，整個實驗操作簡便、快捷、分離度好、重現性好，可用于四環素類抗生素的檢測。

2.4 毛細管電泳法

毛細管電泳技術是經典電泳技術和現代微柱分離技術相結合的一種綠色技術，具有高效、快速、成本低、使用樣本量少、可自動化、應用范圍廣等特點[16]。Islas G等[17]通過固相萃取結合大體積樣品堆積毛細管電泳(SPE-LVSS-CE)的手段，根據牛乳樣品中的金霉素、強力霉素、土霉素和四環素的電荷，在線進行預濃縮，使用具有光電二極管陣列檢測器的毛細管電泳系統進行電泳。LVSS過程中，在流體動力學模式下使用5 Psi的壓力的注入時間，施加電勢和反極性時間。在最佳條件下，該方法的線性范圍為29～200 μg/L，檢測限為18.6～23.8 μg/L，重復性好，且只需要1.0 mL的牛奶，就足以分析低于最嚴格的最大殘留限量的四環素。邵鈺秀等[18]利用電堆積毛細管電泳法測定了乳中四環素、土霉素、強力霉素的抗生素殘留，使用具有紫外分光光度檢測器的毛細管電泳儀，以pH為2.5、20 mmol/L的檸檬酸鹽溶液為緩沖液，分離電壓20 kV，進樣量為25 kV×30 s,檢測的定量下限均為20 μg/kg，遠低于歐盟標準中乳中四環素類抗生素的最大殘留限量。

2.5 分子發光分析法

分子發光分析法是物質在光能、電能、化學能等作用下，從基態躍遷到激發態，在返回基態時以發射輻射能的形式釋放能量，產生發光而建立起來的一種方法，具有靈敏度高、選擇性好的特點[19]。分子發光分析法包括化學發光法、熒光分析法等。

通過化學發光法可以檢測到四環素，四環素的化學發光是超弱化學發光，用肉眼不能直接看到，但可以通過單光子計數技術輕松檢測到[20]。該方法檢測簡單，檢測限低，檢測成本低，使用中等復雜度的設備就獲得合理的靈敏度，無需任何衍生化即可檢測[20,21]。Li Jie等[22]將CL與HPLC結合，采用高效液相色譜-柱后化學發光法，通過鈰(IV)與甲氧基化的辣椒素熒光素類似物系統之間反應能使四環素產生強烈化學發光信號的機制，對樣品中的四環素抗生素殘留進行了痕量分析。

四環素也能采用熒光分析法進行檢測，利用其因吸收了光能而被激發出該物質特性的熒光，從而進行定性或定量分析。對于四環素這類本身不發射熒光或熒光微弱的物質，則需要加入一些試劑或物質，使其在特定的情況下轉化成能發射熒光的物質或擴大其熒光強度[23]。熒光分析作為一種有效的檢測方法，因其靈敏度高和預處理簡單而被廣泛應用于分析領域[24]。但是，由于熒光檢測的選擇性差，因此檢測過程容易受到其他物質的干擾[25]。

2.6 分光光度法

四環素在一定的pH條件下，在紫外區對光有很強的吸收，通過測定其對光的吸收程度可以計算出其含量[26]。該方法靈敏度不夠高，專屬性較差，但也會被運用于簡單的四環素的測定[27]。José Luiz Rufino等[28]已經開發出一種簡單，快速，準確的分光光度法來測定四環素類抗生素，該方法基于四環素類抗生素能與氯胺-T在堿性介質中反應，從而產生紅色產物，四環素和強力霉素的最大吸光度分別在535 nm和525 nm處，四環素和強力霉素的定量限分別為5.63 mol/L和0.71 mol/L，獲得的結果準確、可靠。Sysay Palamy和Wirat Ruengsitagoon[29]開發了一種新穎的流動注射分光光度法，該方法基于強力霉素和植物提取物中所含的鐵(III)之間形成的絡合物在435 nm處有最大吸收峰來測定四環素類抗生素中的強力霉素，檢測限和定量限分別為1.5 μg/mL和4.5 μg/mL，該方法具有操作簡便、經濟、高精度、高準確性等優點。

2.7 電化學法

電化學分析法，四環素在人體內的代謝過程與在電極上的氧化還原反應具有某些相似性[30]，所以，用電化學法測定四環素具有一定的可行性。且該方法具有靈敏度高、準確度高、測量范圍廣、操作簡便等特點[31-32]。Calixto等[33]建立了石墨-聚氨酯復合電極法測定牛乳和母乳中的四環素，其在pH 2.3磷酸鹽緩沖液中使用優化的差分脈沖伏安法參數在石墨-聚氨酯復合電極上獲得的四環素檢出限低至2.6 μmol/L。AyatMohammad-Razdari等[34]研究了一種基于筆形石墨電極修飾的納米材料的阻抗式生物傳感器的檢測方法，該傳感器可用于母乳樣品中的四環素檢測。該研究為提高電極表面的電子轉移速率，選用RGO和AuNPs的組合作為納米復合材料，在最佳條件下，適體傳感器的濃度范圍為1×10-16～1×10-6M，檢測極限為3×10-17M TET。回收率達到92.8%～102.1%。將適體和電化學阻抗譜結合使用是檢測牛奶樣品中TET的一種有前途的方法，具有良好的可重復性，選擇性和穩定性。

2.8 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法是一種免疫學測定法，一般經過多重的抗原抗體反應后再與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測的一種方法，由于操作簡便快速，不依賴于大型儀器設備，廣泛應用于樣本的初篩和定性檢測。曹金博等[35]建立了土霉素的酶聯免疫檢測法，該研究采用重氮化法在土霉素分子中引入羧基，使用改進碳二亞胺法將土霉素與載體蛋白偶聯制備完全抗原，再通過紅外掃描、紫外掃描和凝膠電泳鑒定其偶聯效果，然后將制備的完全抗原免疫BLAB/c小鼠獲得多抗血清，對其免疫學特性進行鑒定后通過優化條件建立土霉素間接競爭ELISA檢測方法。方法的半數抑制濃度(IC50)為32.92 ng/mL，檢出限為1.3 ng/mL。將其應用于牛奶樣品的檢測，加標回收率為84.70%～87.45%，與金霉素、四環素的交叉反應率分別為5.27%和4.10%，與其他競爭物交叉反應率<0.4%，是一種簡便快速的土霉素檢測方法。陳燕妮[36]建立了適合牛奶和蜂蜜樣本檢測的四環素測定的ELASA法。該研究通過合成四環素藥物的完全抗原，利用抗體5B11建立了間接競爭ELASA法。該法對牛奶樣品中四環素、土霉素、金霉素、強力霉素的加標回收率分別為93.5%～101.2%、95.3%～105.1%、95.0%～101.5%、89.9%～92.3%，該法雖然有一定的抗體交叉反應，但操作簡便快速，適用于牛奶樣品四環素的快速檢測。

3 結 語

母乳中四環素及其代謝產物的測定方法研究目前開展不多，而牛奶中相關研究較多。牛奶作為牛的母乳，樣本的性質和人的母乳有很大的相似之處，相關檢測方法可以作為重要參考。但是二者也存在一些差異，比如牛奶樣本的營養素種類和量有一定差異，一些相關的生物蛋白也不一樣，牛奶樣本一般經過一定程度的加工，比如殺菌、水解等，而母乳則是直接供嬰幼兒食用，二者本底基質有所不同。目前，高效液相色譜法和高效液相色譜串聯質譜法應用最為普遍，其他檢測方法由于定性定量能力，或者設備普及原因，主要作為液相和液質法的重要補充。其中，高效液相色譜法由于其主要使用保留時間定性，抗基質干擾的能力也不足，方法的性能上不及高效液相色譜串聯質譜法。隨著液質聯用儀的逐漸普及，其高定性能力和高靈敏度的優勢逐漸顯現，是母乳中四環素其代謝產物測定的研究方向。通過高性能檢測方法的建立，逐步開展母乳相關四環素及其代謝物健康風險評估的工作，進一步了解四環素類抗生素對于孕婦和嬰幼兒的健康影響，制定相應的防控建議，具有很好的公共衛生意義。