延齡草多糖研究進展

付曉云，張紅燕

(昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500)

1 延齡草概述

1.1 分類及地位

延齡草(Trillium tschonoskii Maxim)，百合科延齡草屬多年生草本植物, 別名頭頂一顆珠。其味甘，性平，有小毒，以干燥根和根莖入藥(俗稱“地珠”)，或以干燥果實入藥(俗稱“天珠”)，有鎮(zhèn)靜安神，活血止血，延年益壽的功效，主治外傷出血，頭暈?zāi)垦＃驌p傷等[1]。延齡草屬植物主產(chǎn)于北美，亞洲東部，其中北美有38種，亞洲有11種，我國有3種，包括延齡草(Trillium tschonoskii Maxim)，吉 林 延 齡 草(Tril-lium kamtschaticum Pall.ex Purch)與西藏延齡草(Trilli-um govanianum Wall.ex Ruyle)，主要分布在西北、東北和西南地區(qū)[2-3]。該屬植物為少常用中藥，歷代本草中鮮有記載，主要在我國土家族和苗族地區(qū)應(yīng)用較為廣泛，且療效確切[4]。

1.2 化學成份

查閱文獻報到，延齡草屬植物的次生代謝主要以皂苷為主，主要為甾體皂苷，按結(jié)構(gòu)特點可分為I-V類，同時還有黃酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等類型的化合物[5]；除此之外，還有鞣質(zhì)類、腺苷類和多糖類等活性物質(zhì)[19]。總體來說，國內(nèi)外對延齡草的研究較少，尤其是關(guān)于多糖類活性成份。

1.3 資源與利用狀況

由于環(huán)境因素、人為因素，加之該屬植物種子休眠期長，發(fā)芽率低等自身的生物學特性，延齡草種屬數(shù)量急劇下降，曾被列為國家醫(yī)藥管理局管理的二類藥材，國家三級保護植物[5-7]。隨著張國華等[8]開發(fā)的延齡草栽培技術(shù)，近些年開始了人工種植，資源相對有所提升，對其的研究也越來越深入。

2 延齡草多糖概述

多糖是由10個或10個以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，廣泛存在于動物、植物、微生物中。多糖作為生命物質(zhì)的組成成分之一，它廣泛參與了細胞的各種生命現(xiàn)象及生理過程的調(diào)節(jié)。具有提高免疫，降血糖，抗腫瘤，抗病毒等多種生物活性，被認為是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，是一項很有前景的天然藥物[15-17]。

2.1 延齡草多糖的提取分離

2.1.1 材料預(yù)處理

多糖在植物、動物和微生物中均有廣泛分布。不同植物，動物和微生物的器官和組成千差萬別，多糖提取時，根據(jù)不同的生物體，選擇不同的預(yù)處理方法。在動物類和植物種子中，由于含有大量的蛋白質(zhì)和脂類，提取前一般先用石油醚脫脂或用酶解法除蛋白質(zhì)；植物地上部分因含有大量的葉綠素，提取多糖時，應(yīng)依次使用石油醚、丙酮、乙酸乙酯和乙醇進行脫色素處理；植物的地下根莖中，含有大量的淀粉，在多糖提取前或者提取過程中，應(yīng)去除植物中所含的淀粉，以免影響多糖的性質(zhì)和得率[19]。高晰等[20]采用10倍量甲醇，回流提取兩次，每次2 h，以去除藥材中的單糖、低聚糖、色素和其他脂溶性成分，同時消滅酶活性以防止酶對多糖的降解。

2.1.2 延齡草多糖的提取

多糖在自然界中分布較廣，組成復(fù)雜，其提取、分離方法也各不相同。多糖的提取、分離、純化，必須根據(jù)多糖的理化性質(zhì)、分子量，選擇合適的方法進行。多糖的提取方法主要有傳統(tǒng)的提取方法如滲漉法、浸漬法、煎煮法、回流提取法和較現(xiàn)代的提取方法：超聲波提取法、超臨界提取法、酶提取法等。在傳統(tǒng)的提取方法中，其中滲漉法和浸漬法屬于冷提法，適用于對熱不穩(wěn)定或易被破壞成分的提取。根據(jù)文獻調(diào)查，延齡草多糖的提取方法主要采用熱水浸提法：徐靜靜等[21]采用正交設(shè)計優(yōu)化延齡草多糖的熱水浸提工藝，其結(jié)果是：在最佳提取工藝下，延齡草多糖的提取率為6.75%；高晰等[20]采用水提醇沉工藝提取延齡草多糖，其結(jié)果是：在最佳提取條件下，延齡草多糖的得率為4.96%；周濃等[24]應(yīng)用正交設(shè)計，研究比較回流提取法、熱水浸提法和超聲提取法，結(jié)果表明：回流提取法在最優(yōu)條件下多糖的提取率可達18.72 mg/g；熱水浸提在最優(yōu)條件下多糖的提取率可達23.84 mg/g；超聲波提取法在最優(yōu)條件下多糖的提取率可達24.32 mg/g。總的來說，延齡草多糖的提取率為5%左右，較多采用回流提取法。

2.2 延齡草多糖的純化

經(jīng)水提醇沉得到的粗多糖成分復(fù)雜，不僅包含著分子量不同的多糖成分，而且還包含著蛋白質(zhì)，色素，無機鹽等物質(zhì)。故在多糖的純化過程中，要利用有效的手段去除粗多糖中的雜質(zhì)成分。蛋白質(zhì)和多糖同屬強極性生物大分子，多糖提取液中含有蛋白質(zhì)是一個普遍現(xiàn)象，因此，去蛋白是多糖分離的一個重要過程。植物多糖中游離的蛋白多采用Sevag法，三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法，結(jié)合蛋白多采用酶解法[25-26]。但目前對延齡草多糖的純化報導較少，只有對同屬植物重樓多糖的研究報導。申世安等[19]采用Sevag法研究了重樓多糖中蛋白質(zhì)的去除，其最佳次數(shù)為3次，此時蛋白質(zhì)的去除率為74.47%，多糖的損失率為20.88%。

除蛋白后的延齡草多糖仍為復(fù)雜的混合物，需要對其進一步的分離純化。目前，植物多糖的純化常使用不同類型的DEAE-離子交換色譜和葡聚糖凝膠色譜聯(lián)合使用。申世安等[19]采用DEAE-52色譜柱進行分離滇重樓多糖后，采用SephadexG-100色譜柱反復(fù)分離純化，并用HPLC上檢測純度。韓曉強等[27]采用DEAE-52離子交換柱色譜分離五種云南野生食用真菌多糖，之后用不同孔徑的凝膠柱(SephadexG-200、SephadexG-150、SephadexG-100)進行分離純化，經(jīng)純度檢測最終分離得到了六個均一的多糖。吳向美等[28]也使用同樣的方法純化肉蓯蓉多糖，分離得到17個均一多糖。綜上表明，使用不同類型的DEAE-離子交換色譜柱和葡聚糖凝膠色譜聯(lián)用法適合植物多糖的純化，為延齡草多糖的純化提供了參考。而小分子物質(zhì)、色素、無機鹽等大多采用透析法。

2.3 延齡草多糖的含量測定

多糖的含量測定方法主要有比色法：硫酸-咔唑比色法、苯酚硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、間羥基聯(lián)苯比色法、3,5-二硝基比色法等；色譜法：氣相色譜(GC)法和高效液相色譜(HPLC)法；紅外光譜定量分析多糖方法和紫外分光光度法；此外還有一些新型的測定方法：共振光散射法(RLS)法和生物傳感器法等。何佩娟等[29]綜述了多糖含量測定的各種方法，指出在多糖的測定中，比色法的應(yīng)用較為廣泛。一般常用苯酚硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法，兩種方法均有靈敏度高，結(jié)果較為準確的優(yōu)點，但都操作復(fù)雜、步驟多且繁瑣、只能測定多糖總含量，若存在單糖會對結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。二硝基水楊酸法操作簡便、快速、靈敏度高，在多糖含量的測定中常被應(yīng)用。光譜法具有操作簡單，靈敏度和準確度均相對較高的優(yōu)點，但對儀器設(shè)備有要求。目前，延齡草多糖的含量測定方法主要使用苯酚硫酸比色法。羅利方等[30]優(yōu)化了苯酚-硫酸法測延齡草多糖含量，其中苯酚的濃度為5%，用量為1 mL，硫酸用量為6 mL，水浴溫度為沸水浴，水浴時間25 min，用常溫冷卻法冷卻。其經(jīng)測定了三批南江縣產(chǎn)延齡草多糖的含量，測得延齡草中多糖的含量高達47.98%。為保證延齡草多糖穩(wěn)定、安全和有效用藥提供了數(shù)據(jù)。

2.4 延齡草多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

多糖的結(jié)構(gòu)鑒定需要解決單糖的構(gòu)型、單糖的組成(單糖的種類和比例)、糖與糖的連接位置和順序。

2.4.1 延齡草多糖純度和分子量的確定

研究樣品在進行分析之前，必須對樣品進行純度分析。多糖是大分子聚合物，即使是純品，其微觀也不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，即一定相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)的多糖的平均分布。測定多糖分子量的方法有凝膠色譜法、電泳法、超速離心法、旋光度法、滲透壓法以及聯(lián)用技術(shù)等。中藥多糖主要測定數(shù)均分子量和重均分子量，目前常用體積排阻色譜法(包括凝膠滲透色譜法和高效凝膠滲透色譜法)。2005年版《中國藥典》Ⅱ部中收載了用高效凝膠滲透色譜法測定多糖分子量和分子量分布方法[31]。秦建鮮等[32]也綜述了中藥多糖相對分子質(zhì)量測定方法，簡要的歸納分析了各方法的優(yōu)缺點并進行了對比，篩選出了簡單實用的多糖相對分子質(zhì)量測定方法為高效凝膠滲透色譜法，該方法操作簡單、快速、靈敏、重復(fù)性好和樣品用量少，為測定多糖相對分子量及分子分布的首選方法。金有權(quán)等[33]用高效凝膠色譜法分析了繡球花多糖，結(jié)果為4個組分多糖樣品的平均分子量分別為1.49×105、1.25×105、1.01×105、1.37×105。

2.4.2 單糖的組成分析

單糖的組成主要采用完全酸水解法，常用的酸有三氟乙酸、適當濃度的硫酸、鹽酸等。水解產(chǎn)物可以用紙色譜或者薄層色譜來初步分析樣品是否被完全水解以及得到初步的單糖組成信息，然后根據(jù)實際情況選擇合適的方法對單糖的組成進行定量和分析。羅利方等[30]采用柱前衍生化HPLC法分析了延齡草多糖中單糖的組成，結(jié)果表明延齡草多糖主要是由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其摩爾比1.17:2.56:1.53:98.59:1.99:1.0:18.84，但仍有四個單糖未被指認。研究表明延齡草多糖中主要的單糖為葡萄糖，含量高達36.89%，占總糖的76.88%。多糖中單糖的組成是研究多糖構(gòu)型的重要前提，單糖的連接順序和構(gòu)型等還未有文獻報導，而單糖的連接方式主要使用IR、NMR和甲基化等方法。唐韻等[34]通過熱水提取并通過Millipore(100 kD)和Sephadex G-200純化從梅葉鱗草獲得多糖，用苯酚-硫酸法測得多糖含量為89.9%，高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)估計其平均分子量為2.213×106 Da。單糖分析表明，多糖由阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為2.134:1:2.78:2.82。經(jīng)過Smith降解，甲基化，紅外光譜和NMR后，鑒定了多糖的一級結(jié)構(gòu)。

2.5 延齡草多糖的生物活性研究

20世紀70年代人們發(fā)現(xiàn)了真菌多糖[35]具有抗癌活性，自此人們對多糖的生物活性有了高度重視，現(xiàn)從中草藥和食用菌中分離得到的多糖已有數(shù)百種，其中為植物多糖最多。由于多糖結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性，多糖具有多種多樣的得藥理活性。大量的藥理學和臨床醫(yī)學表明，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，降血脂，抗病毒等功能，且對正常細胞無毒副作用。王益富等[14]探討了百花延齡草水提液對肝纖維化作用和作用機制，經(jīng)腹腔注射四氯化碳構(gòu)建雄性C57鼠肝纖維化模型，給藥百花延齡草水提液0.5 g/kg、1 g/kg，陽性對照為扶正化瘀膠囊(0.75 g/kg),經(jīng)生化實驗表明給藥組和陽性對照組均能顯著抑制 CCl4 誘導的小鼠肝纖維化程度，與模型組相比，給藥組和陽性對照組血清 ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，AST(天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶)水平及肝臟組織中 MDA(丙二醛)水平明顯降低(P<0.01)，SOD 顯著提高(P<0.01); 與模型組相比，給藥組和陽性對照組TGF-β 蛋白表達具有顯著的抑制作用(P<0.01),表明了白花延齡草水提液對肝纖維化有顯著的改善作用；孫艷平等[12]研究了延齡草水提液對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用：主要通過小鼠直接睡眠法、自主活動能力測定實驗、與閾下劑量及閾上劑量的戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠等實驗方法，結(jié)果表明延齡草提取物能減少小鼠自主活動能力和行為，增加由閾下劑量及閾上劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠入睡百分率和睡眠時間，說明了延齡草提取物對小鼠有一定鎮(zhèn)靜催眠作用。目前，關(guān)于延齡草多糖明確的生物活性尚未報導。

3 結(jié) 語

延齡草生長環(huán)境、加工、提取純化方法的不同，導致多糖含量、分子量、單糖組成及摩爾比、連接位置及順序存有一定差異，從而影響多糖的生物活性的強弱。目前，延齡草多糖的提取研究較少，主要還是采用傳統(tǒng)的熱水浸提法，在此基礎(chǔ)上借助超聲和酶輔助提取，一定程度上提高了多糖的提取率，但對于延齡草多糖的工業(yè)化提取方法仍比較落后粗放。延齡草多糖分離純化過程主要包括脫蛋白、脫色和不同多糖組分之間的分離，但對此方面的研究還未有報導，之后可以考慮借鑒其它多糖純化的新途徑、新思路，如膜分離技術(shù)，膜分離與柱色譜聯(lián)合，以便更高效地獲取精制的延齡草多糖，分離純化后延齡草多糖的分子量、單糖組成研究比較也比較少且不完善，還需進一步深入研究。因此，關(guān)于延齡草多糖的研究可以從提取工藝的優(yōu)化、新型技術(shù)在結(jié)構(gòu)分析和含量測定中的使用等出發(fā)，開發(fā)出提取率高、含量穩(wěn)定的延齡草多糖提取工藝和結(jié)構(gòu)確定、療效確切的分析方法，并且探索出一套可控制其質(zhì)量的質(zhì)量控制方法，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，使其能成為安全、穩(wěn)定、有效和質(zhì)量可控的保健食品和藥品原料。